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一文教你如何从细胞中提取高质量RNA

在实验室中,尤其是分子生物类的实验室中不可避免的会遇到细胞总RNA提取实验,所提RNA样品的质量和纯度直接影响下一步的实验,如逆转录,RT-PCR, microarray 等。下面我们来介绍如何提取细胞中的总RNA 。

首先,我们要知道什么是总RNA。总RNA包括mRNA和miRNA,其中mRNA也就是信使RNA,是具有编码蛋白质的功能的RNA,传递遗传信息。miRNA是小型非编码RNA,长度约22个碱基,可以调控或沉默基因表达编码RNA。我们的目的是得到质量好,纯度高,完整的RNA样品。操作如下:

细胞裂解
细胞的获取方式不同,采用的裂解方法也不尽相同。

1)若是组织中提取,按照每50-100mg样品加入1mlTrizol的比例加入Trizol,而后匀浆破碎样品。细胞破碎后在室温下静置5分钟,这样可以分离出核蛋白复合物(nucleoprotein complexes),然后离心去除细胞碎片[2]。
2)若是培养瓶中贴壁细胞,则先用冰PBS洗2次,而后按每10平方厘米区域加入1ml Trizol的比例加入Trizol, 吹打混匀处理。
3)若是悬浮细胞,离心收集细胞,去除培养基,然后加入适量Trizol吹打混匀处理。

可以发现这步操作主要用到了Trizol这个试剂。那么Trizol的作用是什么呢?Trizol的主要成分是苯酚,是有效的蛋白变性剂。它能够抑制酶活性包括RNAaes,这样可以保证RNA不会被降解掉,同时Trizol能够使细胞裂解。

抽提RNA
向EP管中的细胞液加入200ul氯仿,涡旋15秒后,室温静置3分钟,然后4℃,12000rpm,15min条件下离心。离心后分3层,上层为无色或淡粉色含有RNA,中层为白色蛋白质层,下层为红色含有脂质和培养基。我们所需的RNA就在氯仿的作用在分在上层的水相中。

氯仿是有机溶剂,添加氯仿会使细胞内的蛋白变性沉淀,可以通过离心进行去除。同时加入氯仿后,水相和有机相会分层,将水相中的酚抽提以免损伤核酸,另外还能溶解一些脂溶性杂质纯化RNA。

沉淀RNA
吸取上层水相于新的EP管中,不要吸取中间蛋白质层,加入等体积的异丙醇,一般是500ul上清和500ul异丙醇,少的时候可以取200ul的上清。两者充分混匀,室温放置10分钟,然后4℃,12000rpm离心10分钟。离心结束后,弃去上清,管底可见白色胶状沉淀,这就是我们的RNA了。

好奇心强的朋友一定会问了,加入异丙醇的作用是什么呢?异丙醇的作用就是沉淀水相中的RNA并抑制RNA酶活性,其羟基的疏水作用能保护RNA中的亲水基团。

洗涤RNA
为了进行RNA的洗涤,我们需要用DEPC水配制75%的乙醇溶液,现配现用。哪尼?你不知道什么是DEPC水。DEPC水呢,就是是用DEPC(diethyl pyrocarbonate,焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压灭菌的MiliQ纯水,里面不含杂质RNA,DNA和蛋白质。

按照添加的Trizon的量1:1体积配乙醇溶液,一般是750ul分析纯乙醇加上250ul DEPC水,在涡旋仪上使乙醇溶液与RNA充分混匀,4℃,9000rpm,5min离心。然后小心弃去上清,不要吸走管底的RNA哦。

再次洗涤RNA
重复第四步骤,再次洗涤RNA,弃去上清后,控干EP管。,室温下将EP管倒置在吸水纸上5-10min,酌情加入20-50ul DEPC水溶解RNA,这就是我们最终提取到的RNA了。

测定RNA纯度和浓度
用微量紫外分光光度计取1-2ul RNA检测即可。A260/A280值在1.8-2.0间符合纯度。RNA在260nm处有最大吸收,A260=1.0代表RNA的浓度为40ug/ml。A280用于检测蛋白污染,纯RNA样品的A260/A280=2.1,一般所得比值在1.8-2.0间也是普遍认可的。另外,我们也可以测定A230。A230用于检测其他污染,主要来自RNA提取试剂,理想的A230值要大于1.5。另外RNA的完整性可以用1%的琼脂糖凝胶电泳验证[2,3]。

操作注意事项:
1. 在收集细胞时,离心操作过程中离心管中看不见明显的细胞沉淀时,可以在倒置显微镜下观察培养瓶细胞残留,判断细胞是否都消化下来。另外,可以适当延长离心时间。

2.加入氯仿时,要剧烈混匀使两相彻底混匀 。DNA在水饱和酚的酸性条件下是会被留在有机相的,不会跑水相里头去。吸取上清液时尽量不要分到不同的新的EP管中,本身量不多时,尽量集中到一个管中,同时也避免吸到中间蛋白降低纯度。

3.加入异丙醇后没有看到明显的乳白色沉淀时,可以在-20℃过夜再离心,也可以继续按照实验操作往下做。

每个实验室的提取方法可能不尽相同,此处的方法仅供参考交流。在实验过程中遵守操作规范,严谨实验,这样便能大大提高实验结果的准确性和可靠性。

参考文献:
[1] Chi, K. R. The RNA code comes into focus. Nature 542, 503-506, doi:10.1038/542503a (2017).(封面图来源)
[2] http://bitesizebio.com/13529/isolation-of-total-rna-including-microrna-from-cells-and-tissues/
[3] http://bitesizebio.com/13527/how-to-quality-control-check-your-rna-samples/

作者: crystal

高冰,青岛大学研究生在读,研究方向是肿瘤的分子机制。作为爱好动漫的浪漫理想主义逐梦人,喜欢生物,喜欢文字,喜欢一切可爱的东西!



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