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中药现代化的策略浅析——以青蒿素合成为例(上)

中药现代化是近期中医药研究的热点问题,近日,国家食品药品监督管理总局办公厅发布《中药经典名方复方制剂简化注册审批管理规定(征求意见稿)》,对中医经典药方的审核加快流程,昭示着我国对于传统医学继承与发展的决心。

从事生命科学研究的我们,想必有一部分的同学是为了药物开发、生物制药这样的名词来到这样一个领域,在这里,我们将结合“中药现代化”和“生物制药”这两个领域,来解析天然药物的发现与生产研究

首先,中药,又称中草药,绝大部分的中药来自于植物的次生代谢产物,这些次生代谢产物往往来源于植物细胞中的某种底物,如氨基酸、糖类等,最终生成对植物而言有着抗菌、抗虫、传递信号等作用的小分子化合物。

其次,生物制药,关乎生物反应器的概念,传统的生物反应器利用一些原核或单细胞真核生物,采用发酵的手段生物合成小分子多肽类药物和一些特殊的大分子蛋白类药物,对于此类药物来说,黑曲霉、乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、大肠杆菌都是优良的蛋白表达系统;

然而,源于次生代谢的天然药物,很多都是结构复杂的小分子化合物,这些化合物往往需要复杂的酶系进行催化,因此,遗传背景清晰转化体系成熟以及代谢背景适宜往往成为了新型小分子化合物药物生物反应器的需求,其中,大肠杆菌、酵母、烟草等合成生物学底盘成为了主流的选择。

人们最早使用次生代谢产物治疗疾病,要追溯到上个世纪初,弗莱明从青霉菌中提取到了青霉素,拯救了二战时期无数受伤的生命;有趣的是,今天要跟大家分享的,在植物天然产物中最具代表性的药物,名字中也带有同样的字眼,它就是青蒿素

青蒿素之所以举世闻名,皆因为2015年,屠呦呦与另外两位科学家分享了当年的诺贝尔生理学与医学奖,而屠呦呦获得此奖的原因,正是因为其提取鉴定了对于疟疾的治疗有着卓越疗效的一种萜类药物,青蒿素。

在越南战争期间,有无数的士兵在越南的丛林中感染了疟疾,受到当时北越政府的请求,中国开始研发抗疟疾的相关药物,而在此之中的很多故事,最终导致了青蒿素的发现与阿尔特密斯综合疗法的发明。


寄生在血细胞中的疟原虫

关于疟疾的治疗,我曾经在一个知乎回答中呼吁启动基因驱动技术结合抗疟疾基因,改造埃及伊蚊群体,使其不再传播疟疾:

https://www.zhihu.com/question/263656681/answer/272879854

你也可以直接关注那次TED演讲,了解人类抗争疟疾的残酷与新希望的曙光:

https://open.163.com/movie/2016/7/J/D/MBNUHUC2R_MBOE47QJD.html

在这里,我们且说说青蒿素与合成生物学,也就是前面所说的:天然药物的发现与生产——基于天然产物化学的药物发现、基于分子生物学的基因克隆和基于合成生物学的生物制药;

青蒿素,是一种倍半萜内酯,如今,我们已经可以用酵母发酵得到超过25g/L的青蒿素产量,这也使得我们可以更有效地治疗被疟疾感染的病人。

从黄花蒿(学名)中提取青蒿素,并分离鉴定各种化合物,是属于化学家的工作,在这个过程中,我们从植物或者其他生物中分离鉴定出所有的化合物,找出那些我们不熟悉的面孔(新化合物,即这种生物所特有的化合物群,进而推测各种化合物在体内代谢上的关系,随后大量分离提纯这些化合物,实现其体外的化学半合成,以证实我们推测的反应是否真的能够发生。

这些都是化学家的工作,基于此,我们得知了青蒿素在体内是怎样由初生代谢产物变为青蒿素的。这部分研究的历史已经太过久远,因此,在篇文章中,主要给大家介绍的是青蒿素生物合成路径的定位以及代谢工程的实现。

青蒿素的生物合成

青蒿素的生物合成途径,主要分成了四个部分:

  1. 通过甲羟戊酸途径和非甲羟戊酸两条途径形成法尼基焦磷酸FPP
  2. 在紫穗槐-4,11-二烯合酶的作用下,将FPP环化形成青蒿素的中间体紫穗槐-4,11-二烯
  3. 在紫穗槐-4,11-二烯氧化酶的作用下,紫穗槐-4,11-二烯进一步被氧化形成青蒿醇、青蒿醛,进而合成青蒿酸和/或二氢青蒿酸;
  4. 青蒿酸和/或二氢青蒿酸通过一系列酶反应和/或非酶反应形成青蒿素

在这个过程中,我们可以发现,甲羟戊酸途径是可以在细胞质(Cytoplasm)中进行的,而非甲羟戊酸途径是在叶绿体(质体,Plastid)中完成的,这就涉及到了底盘选择的问题,如果选择微生物底盘,那就需要走甲羟戊酸途径;如果选择植物底盘,那就可以走非甲羟戊酸途径。

在此之后的一系列反应,均可以在细胞质中进行,这就为利用微生物底盘合成青蒿素创造了有利的条件——相比之下,一些只能在叶绿体中进行的反应,就不得不使用藻类或植物底盘来进行了。

青蒿素的生物合成途径

我们可以发现,反应之中有几个关键节点:

  1. IPP,是细胞质和质体中两个途径的交汇点,也是进入青蒿素合成途径的关键中间体;
  2. FPP,是初级代谢的终点,次级代谢的起点;
  3. ADS,合成了关键中间产物,紫穗槐二烯;
  4. CYP71AV1,是紫穗槐二烯的氧化酶,该酶催化紫穗槐二烯一路直到青蒿酸;
  5. Dbr1和Dbr2,是产生药效更强的二氢青蒿素的关键酶;
  6. A1dhI,是氧化青蒿醛、二氢青蒿醛变为对应的青蒿酸的关键酶;

根据这些关键节点,我们来进行详细解析:

 

如何产生FPP?这是青蒿素生物合成的第一步,想办法产生FPP,或者选择本身就能产FPP的底盘:

——这就是做药物代谢工程研究的第一步,选择底盘;

选择底盘的时候要考虑这么几个问题:

  1. 有无中间代谢产物,如果有,量上能否满足目标化合物生产的需求;
  2. 根据底盘的遗传背景,选择合适的基因调控元件,能够实现各种水平的表达;
  3. 底盘的转化体系足以转入我们所需要的一系列基因;

延伸开来讲,第一条,我们需要建立底盘的代谢途径库,对底盘的代谢背景充分了解,在这个过程中,KEGG代谢途径库、Reactome代谢途径库是重要的参考:

KEGG代谢途径库:http://www.genome.jp/kegg/pathway.html

Reactome代谢途径库:https://reactome.org/

推荐KEGG,至于Reactome虽然界面更友好但实际上对于代谢途径来说,非常难用。

第二条,关于合适的调控元件,往往需要查阅相关文献来得知,中科院有一个相关的元件库,可以参考:http://npbiosys.scbit.org/regulatoryElement

第三条,需要对整条代谢途径的了解,如何最优化插入片段的涉及,降低整个DNA序列的长度,并了解一系列底盘的相关研究进展,比如酵母染色体的人工合成。

选定了底盘,就可以进行转化的尝试了,就目前的合成生物学技术来说,远远无法做到随心所欲地合成基因组,因此,转入更少基因就可以实现目标化合物的合成的底盘自然是最优的选择。

在青蒿素的生物合成中,甲羟戊酸途径成为了微生物底盘中的首选:

甲羟戊酸途径

关于甲羟戊酸途径中的各步反应暂时先不做介绍,我们主要关注青蒿中其后的一系列次生代谢反应——我们需要从植物中定位并克隆这些基因,转入新的底盘中以进行催化合成。

首先克隆出了ADS,由FPP得到了紫穗槐二烯:Bouwmeester et al., Phytochemistry 1999, 52: 843-854

第一步是得到由FPP到紫穗槐二烯的酶,这个酶是,得到ADS之后,下一个节点是CYP71AV1(由紫穗槐二烯到青蒿酸);

2005年,Bertea等用青蒿叶片微粒体(破碎细胞,细胞内膜结构自行重构封闭形成的小囊泡)处理紫穗槐二烯,在产物中得到了青蒿醇,由此推断在青蒿中存在一个P450氧化酶,能够将紫穗槐二烯催化成青蒿醇;

图中第二种化合物为青蒿醇,最后一种为青蒿酸

随后,2006 年,Keasling和Covello先后从青蒿腺毛中克隆得到了CYP71AV1,能够将紫穗槐二烯连续地催化成青蒿醇、青蒿醛、青蒿酸,是一种多功能酶。

如图所示,青蒿素与二氢青蒿素的差别

2008年,Zhang等通过综合运用蛋白部分纯化、质谱和EST文库的方法从青蒿中克隆得到一个青蒿醛Δ11(13)双键还原酶基因,命名为Dbr2。Dbr2在腺毛中表达最高,特异性地作用于青蒿醛,生成11R-二氢青蒿醛,对青蒿酸、青蒿醇、artemisitene和arteannuin B均无活性。2009年,他们又分离到了Dbr1,这个酶的产物以11S-二氢青蒿醛为主。

2009年,Teoh等从青蒿中分离得到1个醛脱氢酶基因,命名为Aldh1,ALDH1能作用于青蒿醛和二氢青蒿醛,生成相应的青蒿酸和二氢青蒿酸。

在此之后,由于由青蒿酸到青蒿素的合成途径不是很清楚,而化学合成的耗费也不是很高,因此在目前的代谢工程研究中,从青蒿酸到青蒿素的步骤,是化学合成的。

目前,在酵母中、烟草中均实现了青蒿素的生物合成,从以上对于基因功能和克隆的研究来看,从IPP到青蒿醛,我们只需要逐步完成以下思路,即可合成得到二氢青蒿素:

  1. 在底盘中大量得到FPP;
  2. 转入ADS、CYP71AV1、A1dhI得到青蒿素;
  3. 转入ADS、CYP71AV1、Dbr1(Dbr2)、A1dhI得到二氢青蒿素;

单看2、3,需要进行的改造其实并不多,但底盘中基础代谢的改造必不可少,在这一部分上,微生物底盘与植物底盘所需要的基因元件是不一样的。

首先,研究的最初阶段,采用过表达大肠杆菌自身的DXP途径的策略来合成IPP、DAMPP、FPP等萜烯类化合物,但由于大肠杆菌自身的抑制合成机制,产物并没有大幅度提高:Biotechnol. Bioeng. 87, 200–212 (2004).

将MVA途径引入大肠杆菌,转入了三个质粒Nature Biotechnol. 21, 796–802 (2003).

MVA途径是酿酒酵母中产生萜烯类化合物的主要途径,将MVA途径引入大肠杆菌,再引入ADS合酶,工程菌可产生24mg/L的紫穗槐二烯,在进行密码子优化和发酵条件优化后,产量达到了0.5g/L。

大肠杆菌底盘的优势在于转化手段十分成熟,但因为其DXP途径产生的萜烯类化合物含量较低,需要转入外源代谢途径,但是在第一个质粒MevT中,三个酶的表达不均衡导致中间产物累积,抑制了细胞的生长;

随后,研究人员发现,tHMG1的酶活性增加可以解决这种抑制,其机理是前两个酶活性较高,导致了HMG-CoA的积累,而HMG-CoA的积累会消耗大量的A-CoA,导致脂肪酸合成减少,细胞膜的合成受阻,可以通过添加棕榈酸来解决这个问题。

随后,研究人员调整了一些元件,导入了来自金黄色葡萄球菌的两个元件,该策略搭配限制性氮源和碳源的补料手段,将大肠杆菌中紫穗槐二烯的产量提高到27.4g/L。

随后,转入一系列合成酶系,得到了1g/L的青蒿酸产量,但需要20℃才能进行发酵。

研究至此告一段落,但1g/L的发酵产量还不能满足生产需求,那么,如何提高产量呢?我会在下一篇文章中介绍。

作者: 王文昭

植物合成生物学研究者 感兴趣的研究方向是合成生物学制药



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