利用非天然氨基酸起始蛋白的翻译

今天给大家介绍一个合成生物学中比较有意思的研究–利用非天然氨基酸起始蛋白的翻译。

2019年12月11日，耶鲁大学Dieter Soll教授等在Angrewandtw Chemie 发表了一篇名为“Initiation ofProtein Synthesis with Non-CanonicalAmino Acids InVivo” 的文章[1]。根据已有的报道，利用TyrRS-tRNATyr 正交系统，通过识别UAG 密码子，可以有效地将非天然氨基酸引入到蛋白中。在此论文中，作者将Mj-tRNATyr识别元件转移到大肠杆菌tRNAfMet中（图1），设计了一种运输蛋白起始氨基酸的tRNA(itRNATy2)，作为詹氏甲烷球菌TyrRS的底物，成功在体内引发带有不同侧链的芳香族非天然氨基酸(NCAAs)的翻译。同时，研究利用该系统产生了在第一和第二位含有两个不同NCAA的蛋白质，这是在活体内生产完全非天然多肽的第一步。这项工作为合成非天然蛋白质提供了有效的方法，并展示了用非天然氨基酸引发蛋白翻译的共转译机制在大肠杆菌内的通用性。

图1 大肠杆菌起始tRNA(Ec-tRNAfMet)和詹式甲烷球菌酪氨酸tRNA(Mj-tRNATyr)。红色标注的是Mj-tRNATyr 识别元件，蓝色的是对Ec-tRNAfMet  的突变部分。

首先，我们了解下蛋白翻译的起始。在原核生物中，翻译由甲酰甲硫氨酰tRNA合成酶-tRNA对(fMetRS-tRNAfMet)启动，其携带了甲酰甲硫氨酸(fMet)。Ec-tRNAfMet（E.coli initator tRNA）是唯一能够启动翻译但无法延长多肽链的tRNA（后面对这类启动子tRNA简称itRNA），这一特性源自其特有的序列基序，该序列基序允许与核糖体P位点结合，有利于与起始因子相互作用，并排除了延伸因子的相互作用（图2上）。最近合成生物学中比较热门的一个方向是通过抑制终止密码子方法在蛋白质中引入非天然氨基酸（图2下）。Mj TyrRS-tRNATyr 对是该方法常用的工具， 如果用其去替换甲硫酰-tRNA(EC-tRNAfMet)正交对，或许可以实现用非天然氨基酸起始蛋白翻译。作者基于此想法，开展了以下实验。

图2  上图为蛋白起始阶段复合物的形成。下图为终止密码子抑制法引入非天然氨基酸[2]。

作者比较Mj-tRNATyr和Ec-tRNAfMet （图1）发现，A73 和 C1：G72碱基对是两者最大的不同，而在氨基酸臂上的序列通常跟氨基酸的识别有关。所以，作者设计了Ec-tRNAfMet的5个突变体（图3上），将特有位点包含在内，并在Ec-tRNAfMet氨基酸臂和TΨC臂上做大量突变，目的是为了获得一个Ec-tRNAfMet，既能识别起始位点，又能和非天然氨基酸结合。作者选择sfGFP 做为报告基因，将起始密码子AUG 突变成UAG（sfGFP-1am)，选择荧光/OD的方法做为Ec-tRNAfMet的活性表征。根据实验数据，itRNATy2在起始密码子处引入非天然氨基酸的效率较其他突变体好（图3下  图左）。而由于Ec-tRNAfMet的突变体有了引入非天然氨基酸的功能，所以作者同时测试了各个突变体的延伸阶段引入非天然氨基酸的效率。通过设计sfGFP 第2个密码子突变（sfGFP-2am）进行实验验证，作者发现Ty2有较弱的荧光强度（图3下  图右）。经过检测起始阶段和延伸阶段各个突变体的表现，研究证明itRNATy2有较强的起始活力和较弱的延伸活力，故将其作为目的tRNA。

图3  图上为设计的Ec-tRNAfMet的5个突变体。其中红色部分为与原始Ec-tRNAfMet不一致的部分。图下为分别在起始阶段和延伸阶段对5个突变体的活性测试。

然后作者发现了一个问题，itRNATy2与酪氨酰tRNA合成酶（TyrRS）结合效率低，极有可能是因为被Ec-tRNAfMet 竞争性抑制，竞争P位点的结合。而根据相关报道，编码Ec-tRNAfMet的基因有metY, metZ , metW 和 metV，其中敲除metZWV基因，可有效降低EC-tRNAfMet的浓度。于是，作者构造了ΔmetZWV型菌株，在DH10B 和 KL16 两种不同的菌株上进行了实验。结果发现，ΔmetZWV型菌株较野生型在起始阶段的活力明显提升，在延伸阶段的活力不变或略微下降，说明敲除metZWV基因是有效果的（图4）。

图4  起始阶段和延伸阶段野生型和ΔmetZWV型菌株在DH10B 和 KL16的表达情况。

经过上述的实验，作者得到了能够起始蛋白翻译的itRNATy2以及能够提高活性的菌株ΔmetZWV。然后作者开始了下一步的尝试，利用新开发的正交系统与已经报道的Pyrrolysyl-tRNA synthetase (PylRS)/tRNAPyl 正交系统在蛋白质前两位引入非天然氨基酸。将sfGFP的第1位和第2位密码子分别突变为UAG和UAA，然后加入非天然氨基酸MeF（4-甲基苯丙氨酸）和BocK（叔丁氧羰基赖氨酸），被两套系统分别识别，发现在sfGFP 的第1个和第2个氨基酸位置能够成功引入两个非天然氨基酸，且ΔmetZWV菌株内蛋白质表达水平较野生型有很大提升（图5）。

图5 非天然氨基酸引入情况

最后，作者指出能在蛋白起始位置引入非天然氨基酸，为后续构造非天然氨基酸组成的蛋白打下了基础。

参考文献

[1] Angew.Chem.2020, 132,3146–3150

[2] Translation Mrna To Protein – Initiation Translation, HD Png Download – vhv 

[3]ACS Chem Biol. 2018;13(4):854-870.