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浙大于洪巍实验室Biotechnol Bioeng文章:采用温度切换调控酿酒酵母中的生物合成途径

近年来,采用合成生物学的方式改造微生物进行大宗化合品或者高附加值化合物的合成已经成为国内外多个课题组研究的热点。传统的微生物细胞代谢途径改造,通常采用的是代谢途径中酶的进行过表达,但该种策略往往使用组成型强启动子而造成宿主细胞代谢压力,从而影响细胞生长以及目标产物的合成。

一般而言,若能够在宿主细胞中实现生物合成途径基因的可控表达,在合适的时间,以适当的强度开启目标合成途径,使细胞生长与产物积累分阶段进行,则能够在很大程度上避免生物量积累和产物积累之间的冲突。

2018年1月24日,浙江大学化学工程与生物工程学院于洪巍教授课题组在生物化工国际权威期刊Biotechnology and Bioengineering上在线发表了题为:Development of a temperature-responsive yeast cell factory using engineered GAL4 as aprotein switch的文章。在该文中,作者采用温度作为动态代谢调控的输入信号,实现了在发酵过程中通过温度切换控制酿酒酵母中外源代谢途径的开启和关闭。

首先,作者利用酿酒酵母中经典的GAL调控系统中的GAL80-GAL4-GAL promoter三者之间的作用和反作用关系,敲除了调控系统中的GAL80抑制蛋白,使得GAL启动子的活性直接与GAL4相关。据此原理,若外源合成途径基因均采用GAL promoter控制表达,则该途径的表达强弱与转录因子GAL4的活性呈相关性。

接着,作者很巧妙地设计了一个高通量筛选方法。在敲除了GAL80基因和GAL4基因的酿酒酵母细胞内整合了GAL1和GAL10 promoter控制的番茄红素合成途径,用于作为高通量筛选的宿主。借助酿酒酵母高效的胞内同源重组机制,结合定向进化技术对组成性启动子控制下的GAL4转录因子进行了温度敏感型突变体的筛选(下图a和b)。由于作者需要的是温度敏感型的GAL4突变体,因此,在只需要在酵母的正常生长温度(30℃)生长环境下为白色的菌落即为GAL4无活性的克隆,将此类克隆挑选,再点菌到平板上低温环境下生长(文章中采用的为21℃),若原来在30℃生长的白色菌落在21℃条件下变红色,说明此克隆中的GAL4突变体在30℃和21℃呈现出非活性→活性状态的转变。由此反复再验证,则可得到温度敏感型的GAL4转录因子。由于菌落是否产番茄红素能很容易用肉眼进行分辨,采用这种方法也就大大简化了突变体库的筛选。

为了进一步验证所筛选温度敏感型GAL4蛋白,作者将所筛选的突变体整合进了酵母染色体中替代了之前的野生型GAL4基因,并进行了GAL启动子控制下基因表达的real-timePCR验证和GAL启动子控制下的EGFP基因表达强度验证,均证实了通过切换培养温度,可以有效控制GAL启动子驱动下的基因表达水平。由此构建的新菌株,GAL启动子的转录由通常敲GAL80基因的葡萄糖控制模式(下图a)变成了温度信号控制模式(下图b)。

此外,作者利用该温度调控系统构建了一株受温度调控的高产番茄红素的菌株Ylyc-TS03(+),并对其进行了高密度发酵实验,实现了细胞生长阶段和产物合成阶段的分阶段精细调控,使最终OD达到了280,产量达到了1.14g/L,菌株在产量方面较携带野生型GAL4基因的菌株提高了177%,这在应用上也证实了温度调控模式有利于次级代谢产物的合成。

该文的研究中作者筛选到了低温具有活性的GAL4突变体,若能再设计实验,筛选到只有在高温条件下才具有活性的GAL4突变体,或许将具有更好的应用意义。

合成生物学通过设计生命、合成再造、重塑生命,开创全新科学研究模式,在健康、药物、化学品生物制造、生物燃料合成、环境等领域形成颠覆性技术。在最近发布的合成生物学重点专项2018年度项目申报指南就提出了:将围绕基因组人工合成与高版本底盘细胞、人工元器件与基因线路、人工细胞合成代谢与复杂生物系统、使能技术体系与生物安全评估等 4 个任务部署项目。

其中的人工元器件与基因线路一直以来都是合成生物学研究中较为重要的一方面。各国的研究者在开发与天然化合物合成或底盘细胞调控/正交线路构建等功能相关的生物元器件功能预测、设计、标准化表征、改造与构建的技术已做了不少研究。

总体而言,为了控制目标工程菌株中目标途径/基因的表达,所采用的基因表达调控措施无外乎为:1)化学信号控制;2)物理信号控制。以往的研究中这两种控制主要体现在对启动子的改造上。

化学信号控制方面:例如基于营养物质的控制(糖类及其类似物,磷元素,胞外氨基酸浓度,胞外金属离子浓度等)和基于细胞密度调控的基因回路(lux群体感应系统、Esa群体感应系统和信息素群体感应系统)已经在细菌和酵母中得到了较为广泛的应用。上述信号控制往往是单向的,信号输入到体系中后不便于解除。

物理信号控制方面:例如采用蓝光诱导的T7RNA聚合酶在大肠杆菌中实现了应用(可参考原文:https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acssynbio.7b00169)。物理信号控制的优点在信号的输入和终止操作可控性强。由于光照培养在大规模发酵过程中并不易实现,或者需要对现有的发酵设备进行升级改造,因此其在大规模发酵中的实际应用也存在一定问题。相比较而言,诸如该文中采用温度调控转录因子的模式更适合放大生产使用。参照该原理,T7 RNA聚合酶是否也可以开发出具有温度敏感型的突变体呢?

作者: yuhongwei

浙江大学化学工程与生物工程学院生物工程研究所教授,博导。研究领域:酶定向进化及理性设计,酶催化手性药物拆分及合成的研究,代谢工程与合成生物学等。



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