您的位置 首页 蛋白技术

蛋白纯化FAQs

Q1:在大肠杆菌蛋白质表达系统中,可以从细胞裂解物的可溶性部分或不可溶性部分纯化蛋白质吗?

A1:我们可以从两个组分中纯化蛋白质。它将取决于客户的实验需求或。我们的科学家在蛋白质复性方面有很好的经验。选择特定的复性策略是基于蛋白质的序列及其结构特性。

Q2:如果使用亲和标签,是否可以在纯化后把它从蛋白质中切割出来?

A2:是的,我们使用可以在纯化后被切割下来并从纯化的蛋白质中去除的标签(例如,通过在基因合成过程中引入凝血酶或TEV蛋白酶切割序列-一些氨基酸可能在切割后留在蛋白质上)。

Q3: 固定化抗体后,第一次亲和纯化蛋白效果良好,但在第二轮纯化过程中蛋白未能与抗体结合,是什么原因?

A3: 低pH洗脱是亲和纯化最常用的洗脱方法,但它可能导致某些抗体变性,从而对随后的抗原结合产生负面影响。为了防止这种情况发生,在蛋白质纯化之后,立即用中和或结合缓冲液洗涤柱子,并将其储存在含有抗菌剂如叠氮钠的缓冲液中,温度为4℃。或者,使用近中性,高盐洗脱缓冲液,如Pierce Gentle Ag/Ab Elution Buffer。

Q4: 纯化具有半胱氨酸的抗体,应该用什么办法呢?

A4: Sulfolink偶联树脂(SulfoLink Coupling Resin)或超临界碘乙醛树脂(UltraLink Iodoacetyl Resin)将是不错的选择,它们利用相同的化学反应与还原的硫醇基团反应。

Q5: 生物素亲和纯化是如何实现的?

A5: 固定化亲和素、链霉亲和素或中性亲和素用于纯化生物素裂解分子。这些分子与生物素的高亲和力要求不可逆变性以释放生物素本身(包括在SDS-PAGE样品缓冲液或8M胍、pH 1.5中沸腾)。

Q6: 能提供一些关于蛋白纯化后蛋白再折叠的建议吗?

A6: 请阅读下面的建议:

*保持低蛋白浓度10-50μg/ml。

*二硫键有助于稳定天然蛋白质;添加氧化还原对,如GSH(还原型谷胱甘肽)。

*GSSG(氧化型谷胱甘肽),其比为10:1,GSH浓度为2-5mm。这种氧化还原对有助于在折叠过程中产生破坏和建立新的S-S键的氧化电位。

*通过稀释或透析缓慢去除变性剂;甘氨酸(50mM,pH 9.0,5mM EDTA)有助于溶解蛋白质。如果使用GuHCl(盐酸胍),加入2M尿素,因为尿素也有助于稳定蛋白质折叠。

*在非常低的浓度下添加洗涤剂,例如0.1-0.5%的NP40或0.005%(V/V)Tween 20。

*包括用于稳定蛋白质的共溶剂,如甘油(5-20%)或PEG 8000或葡萄糖或蔗糖(10%)。

*某些阴离子(例如,磷酸盐或硫酸盐)或阳离子(例如,MES或HEPES)也具有积极作用;包括盐并保持中性pH,例如100mM KCl,或150-500mM NaCl,2mM MgCl2

*通过添加蛋白酶抑制剂,如0.5mM PMSF、0.005-2g/mL抑肽酶、2g/mL抑肽酶或2-5g/mL亮肽素来避免蛋白质降解。

*磷酸盐缓冲液在抗钙时透析将导致磷酸钙沉淀。如果随后的肠激酶消化需要CaCl2(10mM Tris pH 8,10mM CaCl2),记得在透析完成后加入CaCl2

Q7: 使用相同的亲和柱可以执行多少次纯化?

A7: 这随着固定化蛋白质的稳定性和所用洗脱缓冲液的类型而变化,通常可以重复使用色谱柱至少10次而不会显著损失活性。

卡梅德生物科技(天津)有限公司真诚期待与您的合作!

作者: KMDBIOSCIENCE

卡梅德生物科技(天津)有限公司位于天津市的西北部-武清区,研发中心位于湖北省武汉市洪山区,是集研发、生产、销售为一体的综合性创新技术应用企业。公司旨在为客户提供高质量的实验外包服务(CRO服务),包括实验方案设计,常规基因工程实验操作,重组蛋白表达与纯化,重组抗体制备,天然蛋白分离与纯化,病毒分离培养等免疫学相关技术服务;同时我们也为工业客户提供部分IVD级别抗体和抗原原料。



发表评论

您的电子邮箱地址不会被公开。

联系我们

联系我们

(44)07934433023

在线咨询: QQ交谈

邮箱: info@bioengx.org

关注微信
微信扫一扫关注我们

微信扫一扫关注我们

关注微博
返回顶部
Designed by

best down free | web phu nu so | toc dep 2017