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质粒抽提实验方案

质粒抽提实验方案

质粒抽提实验流程:如图片所示

  1. 菌体收集

* 从选择培养基中挑取单克隆菌落,接种到含有适当浓度抗生素的2-5毫升LB培养液中,37°C条件下剧烈震荡(300 rpm)培养8小时。

* 将培养后的菌液按照1:500到1:1000的比例稀释至3 ml选择性LB培养基中,37°C条件下剧烈震荡(300 rpm)培养12–16小时。

* 6000 x g离心15分钟后收集菌体细胞,并尽可能去除上清。在0.1-0.5 ml的悬浮缓冲液(50 mm Tris-Cl,10 mm EDTA,100μg/ml RNase A,PH 8.0)中重新悬浮细菌颗粒,直到没有细胞团块。

  1. 细胞裂解

* 密封管中加入0.25毫升裂解缓冲液,用力翻转4-6次使其充分混匀,室温(15-25°C)条件下孵育5分钟,不要旋涡,否则会导致基因组DNA断裂。裂解后的菌液应该看起来呈粘稠状,注意裂解反应应控制在5分钟内。

  1. 中和反应

* 加入0.3ml中和缓冲液,用力翻转4-6次后置于冰上孵育5分钟。加入中和缓冲液后会形成絮状白色沉淀,使得混合物的粘性降低。沉淀出来的物质中包含基因组DNA、蛋白质、细胞碎片等。溶解液应充分混合,以确保十二烷基硫酸钾沉淀均匀。如果混合物仍然粘稠,则需要进一步的中和,以达到完全中和的效果。当悬浮液为均匀无色状态时,表明SDS已有效沉淀。

  1. 过柱

* 将上清液小心地转移至吸附柱并安装至收集管中,13,000 rpm离心1min。

* 若上清液较浑浊,则需进行第二次较短的离心,以避免将悬浮物或颗粒物质保留在吸附柱上。悬浮物(使样品显得浑浊)会堵塞吸附柱,减少或消除流量。

  1. 柱平衡

* 向放置于收集管中的吸附柱中添加0.7 ml的洗涤缓冲液,13,000 rpm离心10min。然后使用1 ml平衡缓冲液(750 mM氯化钠,50 mM氯化钾,pH7.0,15%异丙醇)进行平衡。

  1. 洗脱

* 用0.8 ml洗脱缓冲液(1.23 mNaCl,50 mM Tris-Cl,ph 8.5,15%v异丙醇)洗脱DNA,在1.5 ml或2 ml离心管中收集洗脱液。

* 通过向洗脱的DNA中添加0.7倍体积(0.56毫升/0.8毫升洗脱体积)的室温异丙醇沉淀DNA,≥10,000 rpm离心30min,去除上清。

* 1ml 70%乙醇洗涤DNA,10,000rpm离心10分钟,去除上清。用70%的乙醇去除沉淀盐,用更易挥发的乙醇代替异丙醇,使DNA更容易再溶解。

* 将吸附有质粒DNA的硅胶膜风干5-10分钟,然后在合适的缓冲液(例如,TE缓冲液,pH8.0或10mm tris-Hcl,pH8.5)中重新溶解DNA。

  1. 产量的测定

为了定量核酸浓度,在TE缓冲液中稀释质粒DNA 1:100或1:50(取决于质粒拷贝数),并在260 nm(A260)和280 nm(A280)处测定吸光度(光密度),使用TE缓冲液作为空白对照。此测量方法可使用公式直接计算核酸浓度:

[DNA] (μg/mL) = A260 × Dilution factor × 50

 

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作者: KMDBIOSCIENCE

卡梅德生物科技(天津)有限公司位于天津市的西北部-武清区,研发中心位于湖北省武汉市洪山区,是集研发、生产、销售为一体的综合性创新技术应用企业。公司旨在为客户提供高质量的实验外包服务(CRO服务),包括实验方案设计,常规基因工程实验操作,重组蛋白表达与纯化,重组抗体制备,天然蛋白分离与纯化,病毒分离培养等免疫学相关技术服务;同时我们也为工业客户提供部分IVD级别抗体和抗原原料。



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