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酶切位点,保护碱基,kozak序列,这些引物设计要素你掌握了么

首先,限制性酶切位点就不用多说了吧,它就是DNA分子上被特异性的核苷酸序列(4-8bp),能被限制性内切酶识别,从而切割。

保护碱基:限制性内切酶识别特定的DNA序列,除此之外,酶蛋白还要占据识别位点两边的若干个碱基,这些碱基对内切酶稳定的结合到DNA双链并发挥切割DNA作用是有很大影响的,被称为保护碱基。【百度百科】

Kozak序列:KOZAK是一个女科学家,她研究过起始密码子AUG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响,并总结出在真核生物中,起始密码子两端序列为:—— G/N-C/N-C/N-ANNAUGG——,如GCCACCAUGG、GCCAUGAUGG时,转录和翻译效率最高,特别是-3位的A对翻译效率非常重要。该序列被后人称为Kozak序列,并被应用于表达载体的构建中。

所以,引物设计上游引物就是在起始密码子前面5‘-保护碱基+酶切位点+Kozak+ATG+一小段目的基因序列

下游引物不用加Kozak序列,通常是5‘-保护碱基+酶切位点+终止密码子+(如果你有要表达的标签序列)+一小段目的基因序列

注意,我这里的介绍的引物设计针对目的基因要表达的,pcr出来后是要连接到表达载体上的,所以引物比较长,一般都有40多bp了,不过一样能够p出来。

好了,下面随便找一个基因为例来实战一下,比如我要将Stat5a从一个公司给的质粒上p出来,然后连接到一个表达载体上,采用直接双酶切目的基因和表达载体,然后连接的方式。在UCSC上找到Stat5a的CDs区。

从起始密码子ATG到终止密码子TGA复制到一个word里,

接下来用DNAMAN看这段CDs区里面存在哪些酶切位点,然后根据你表达载体多克隆位点存在哪些酶切位点,选择两个在表达载体多克隆位点有但是CDs区里面没有的两个酶切位点进行设计。不然内切酶把你的目的基因切断了就玩不下去了。。。。。

假设我以BamH1、Sal1分别作为上下游的酶切位点

好了,现在去百度找酶切位点保护碱基

百度文库很多这样的表,找到BamH1、Sal1,注意该表格后两列表示酶切2h、20h的酶切效率,当然是选最高的那个最好。

百度文库很多这样的表,找到BamH1、Sal1,注意该表格后两列表示酶切2h、20h的酶切效率,当然是选最高的那个最好。

上游:CGCGGATCCGCCACCATGGCGGGCTGGATTCAGGC

下游(特别注意要你设计出来的要反向互补):GCGTCGACTCAGGACAGGGAGCTTCTA

好了,引物就这样设计好了,很简单有没有~~~

??用DNAMAN怎么找酶切位点,下次再说~~~

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致力于简单科普的小白~~~~

辛苦码字,请默默点赞个吧~~~

作者: 生化菇

误入了生化这个大坑~~来不及后悔了~~ 跳出生物这个坑,准备入IT; 自学前端/自学java/自学python/自学php/



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