在分子克隆实验中，获取基因的全长开放读码框（ORF）有时候会是一个挑战。对于新手来说，这个实验有时候可以卡很久。但这绝对不是传说中看脸的实验，而是有很多方法将成功率堆到近乎100%的。这篇文章将为大家讲解获取全长ORF的一些秘诀。
不，你听我解释……真不是上面那样子的……
选择合适的起始材料
首先应该明确，我们的实验目的是获取ORF，而不要引入其他的复杂因素。因此，我们应该选一些好抽提RNA的材料来做实验（比如培养的细胞），而不是非得跟自己过不去，偏偏选择一些难处理的样本（比如组织样品，还是难搞的那种）。
其次，要查清楚所选择的材料中，目的基因的表达量有多高。比如说，我们要克隆GFAP基因。这个基因主要在脑星形胶质细胞中表达，而在其他类型的细胞中表达量极低，甚至不表达。因此，如果要克隆这个基因，就务必使用胶质细胞来提取RNA。此外，GFAP基因在一些病理情况下表达会降低，比如在一些胶质瘤细胞中就不表达了。所以，在正式动手之前，一定要好好调查手头的原材料到底有没有表达目的基因。
基因表达量的信息去哪里查呢？如果是人类样本的话，这里推荐两个数据库：The Human Protein Atlas（HPA，http://www.proteinatlas.org/）和GTEx（https://www.gtexportal.org/home/）。只要输入基因的名字，就可以看到这个基因在各组织器官的表达水平了。其中，HPA整合了一部分GTEx的数据。所以一般来讲，查一个就够了。
而如果是研究其他物种，暂时来说，最好是去查专门的物种基因表达数据库。另外也可以试试这个数据库：Expression Atlas（https://www.ebi.ac.uk/gxa/home/），可以检索基因不同物种在不同部位的表达情况。
抽提高质量的RNA
要扩增出全长的ORF，首先要保证一开始提取的RNA的完整性。涉及RNA的实验，往往要注意所使用的器具、试剂、耗材不含有RNA酶（RNase）。同时，也得注意周遭的环境，找一个干净整洁的地方来操作。
不过，要防止RNase的污染，并没有想象中的那么复杂，也不是像传说中那样，器具耗材需要泡DEPC、实验者要戴口罩等。之前的一篇文章，专门探讨这个问题：实验 | RNA提取实验中的那些玄学
简单来说，常规的高温高压灭菌已可认为灭活了RNase。而吸头与离心管可以直接购买无核酸酶认证的产品。在实验过程中，也无需特别注意低温操作。我现在用QIAGEN的RNA抽提试剂盒，全程都是室温操作，包括裂解、离心、洗涤等步骤，从未发生过RNA降解的情况。
逆转录引物
逆转录实验所使用的引物包括了Oligo dT，随机六聚体（Random hexamer）和基因特异引物（GSP）三种。每一种引物，都有其特定的适用范围。比如说，如果合成的cDNA是要用来做基因表达量研究的，一般建议使用Anchored Oligo dT（3’端带有两个锚定碱基），保证逆转录产物的能够代表原始RNA的丰度。但如果是要拿全长ORF，在引物的选择上就有所讲究。
常用的Oligo dT引物可以选择性地将含有poly A尾巴的RNA——即所有的蛋白质编码RNA和部分长链非编码RNA，给逆转录出来。但是，逆转录酶沿着逆转录引物从5’->3’端一路合成过去，是需要“翻山越岭”的。因为，RNA的三级结构非常复杂，并不是老老实实的一条线性的单链，而是会形成各种茎环结构和其他折叠结构。因此，逆转录酶往往会跑到一半就卡住跑不动，然后从模板链上掉下来，cDNA合成到一半也就中止了。这就导致了，Oligo dT所拿到的cDNA具有3’端偏好性。（见下图）
Hexamer对整个转录组的覆盖度是最高的。因为它不需要RNA模板携带特定序列，也不需要像Oligo dT引物一般从RNA的末端开始逆转录，而是可以好几条Hexamer贴到一条RNA链的各个部位，直接引导逆转录的进行。不过，由于逆转录依然是从引物的5’->3’端进行。如果某个RNA模板的末端（即3’端）没有Hexamer的结合，它的末端就无法被逆转录成cDNA。也就是说，Hexamer所拿到的cDNA具有5’端偏好性。（见下图）
怎么办？貌似挑哪种引物都不好啊。解决方法超级简单，只需在逆转录时，把Oligo dT和Hexamer都加进去反应体系就好了。
使用耐高温H minus逆转录酶
目前市售的逆转录酶，有AMV和MMLV两种来源。以前，实验者还需要为选择哪一种逆转录酶头痛。因为在比较“古早”的时候，这两种酶有各自明显的优势和缺陷：AMV逆转录酶耐高温，而高温有助于打开RNA的高级结构从而有利于反应进行，然而携带RNase H活性，会边逆转录边降解RNA模板，导致产率低，cDNA长度普遍在5 kb左右。而MMLV逆转录酶的RNase H活性低，但不耐高温，无法逆转录具有高级结构的RNA。
现在的实验者则幸福多了，完全不需要烦恼这些问题。得益于对MMLV逆转录酶的工程改造，我们已经获得了一些移除RNase H活性，提高热稳定性但又保留逆转录活性的突变体，并制成了商品化试剂。其中有性能优异的Invitrogen SuperScript系列，但价格也很感人，不到特殊的珍贵样品我不拿出来用。一般情况下，常规的耐高温H minus逆转录酶（比如我自己选用的Thermo Scientific Maxima H Minus），就能满足需求。这些酶能在50℃甚至更高的温度下催化反应进行，而这样的高温已经足以打开绝大多数RNA的高级结构了。
性能很强悍没有之一的SuperScript IV，但价格非常感人……
所以我一般用这个，甚至不买kit只买酶，剩下dNTP和RT引物都可以去合成，便宜到掉渣。当然你可选用任何惯用的产品。
用组装的方法获得长链DNA
哺乳动物平均mRNA长度略大于2,000 nt，微生物的会更短一些。但是，有一些奇葩的基因，其mRNA的长度会突破天际。比如Titin（TTN）基因的转录本是人类最长的mRNA，全长108,861 nt。我以前曾经碰过一个CBP（CREBBP）基因，转录本破10 k碱基。
用PCR的方法，从cDNA那里一次性扩出10 kb甚至更长的片段，往往是非常困难的。这不光是PCR效率的问题。在一管逆转录产物中，完整性那么好的cDNA模板，数量也不会很多。就算是欧皇，电泳看到条带了，但一测序可能会发现好几个突变，这种情况真的会让人很想死。
不过，现在DNA片段拼接试剂盒已经非常成熟。假如一次性拉不出那么长的片段，那就用几条短片段给组装出来。如果大家有兴趣，我可以再写一篇文章，介绍Gibson assembly技术。
目前，全基因合成服务公司所采用的技术路线，也是先合成小片段再拼接的。
Gibson assembly是一种能将多个小片段无缝、定向组装成大片段的技术
总结
话说……如果Addgene有得卖的话，那直接去买算了……
buy nizoral generic – sporanox 100 mg cost buy itraconazole 100 mg generic
order rybelsus online cheap – purchase desmopressin buy generic desmopressin over the counter
[url=http://lisinoprilos.online/]lisinopril 40 mg price[/url]
where to buy lamisil without a prescription – lamisil pill where to buy grifulvin v without a prescription
buy generic prandin – order repaglinide 2mg buy generic jardiance over the counter
micronase 5mg cheap – generic actos 30mg buy forxiga online
methylprednisolone 4 mg oral – methylprednisolone 16mg without prescription buy azelastine medication
desloratadine for sale online – aristocort pills order ventolin online cheap
stromectol for lice – buy cefaclor no prescription purchase cefaclor online cheap
cost albuterol 4mg – buy theo-24 Cr 400 mg pills buy cheap theo-24 Cr
I love looking through an article that can make men and women think.
Also, many thanks for permitting me to comment!
Feel free to surf to my web page; vpn special
azithromycin order online – order metronidazole 200mg online cheap buy ciprofloxacin online
I know this if off topic but I’m looking into starting my
own weblog and was curious what all is required
to get set up? I’m assuming having a blog like yours would
cost a pretty penny? I’m not very web smart so I’m not 100% sure.
Any tips or advice would be greatly appreciated.
Thanks
Also visit my web page: vpn coupon 2024
augmentin us – acillin brand cipro online buy
Good day! Do you know if they make any plugins to assist with Search Engine Optimization? I’m trying to get my site to rank
for some targeted keywords but I’m not seeing very good success.
If you know of any please share. Many thanks!
I saw similar article here: Backlink Portfolio
order anafranil 25mg generic – purchase aripiprazole pills order sinequan 25mg
atarax 25mg uk – buy buspar without prescription order amitriptyline online
where can i buy quetiapine – buy bupron SR sale eskalith uk
order clozaril 100mg without prescription – buy coversum tablets how to buy famotidine
metformin online buy – purchase lamivudine lincocin 500mg pills
buy zidovudine 300mg – buy zyloprim 300mg online cheap allopurinol cost
buy furosemide without a prescription – order warfarin 5mg sale captopril 25 mg tablet
buy acillin cheap order amoxil for sale buy generic amoxil over the counter
buy metronidazole 200mg without prescription – purchase cefaclor pill buy zithromax 500mg sale
ivermectin 6 mg without a doctor prescription – generic aczone buy generic tetracycline 500mg
Wow, amazing weblog format! How lengthy have
you ever been blogging for? you made blogging look easy.
The full look of your site is excellent, as smartly as the content material!
You can see similar here sklep internetowy
valacyclovir 500mg tablet – nateglinide 120mg for sale order acyclovir sale
generic ciprofloxacin 500mg – buy doryx purchase erythromycin generic
purchase flagyl – oxytetracycline 250 mg sale buy zithromax online
cheap cipro 1000mg – order cephalexin without prescription cost clavulanate
ciprofloxacin canada – cephalexin medication buy augmentin no prescription
cheap atorvastatin 40mg lipitor brand buy generic lipitor for sale