浅谈基因工程抗体

前言
人体是一个复杂且又统一的整体，需要多个系统共同协作完成其功能。免疫系统作为其中一个系统，在复杂性方面被认为仅次于神经系统。作为先天和适应的保护机制，免疫系统由体液和细胞完成其免疫功能。抗体，作为体液免疫应答的产物，一直以来备受关注。人们可以在合适的宿主中针对抗原产生特定抗体的事实使得它们成为具有看似无限应用的有价值的生物学分子。

Kohler和Milstein在1975年创建了淋巴细胞的杂交瘤技术并获得了专一识别抗原位并与之特异结合的单克隆抗体，并于1984年荣获诺贝尔医学奖。此举开创了抗体开始广泛地作为治疗性药物的新时代。单克隆抗体与多克隆抗体相比，可以更有效地发挥药效并具有更小的毒副作用，已基本取代多克隆抗体用于基础研究和临床诊断。1982年，用鼠特异性单克隆抗体治疗了淋巴瘤患者的成功引起了人们的极大关注。随后的几年中，被誉为“魔法子弹”的单克隆抗体治疗肿瘤的生物导弹治疗策略如雨后春笋般崛起。大量的鼠单克隆抗体被研发并快速推进于临床试验，然而众多临床试验发现，鼠单克隆抗体因对人来说具有异源性，引起患者强烈的人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody，HAMA）反应；并且由于完整的抗体相对分子量较大，到达组织或靶器官的量极少。因此，单纯的用鼠单克隆抗体治疗疾病难以发挥理想的药效，还带来了难以接受的毒副作用。

20世纪80年代后期，随着新兴的分子生物学的迅速发展，使得人们可以通过基因工程技术对天然的分子进行人为的改造，这为抗体药物带来了新的突破点和希望。了解抗体分子的结构和阐明其结构功能关系为使用mAb用于各种应用尤其人类治疗领域提供了新的推动力。目前，常规单克隆抗体的生产和抗体工程相结合已经产生了一些具有诊断，研究和治疗应用的产品。在本文中，我们将介绍抗体工程抗体的方法，种类，产品及其要点介绍。

一、人源化基因工程抗体改造
1.抗体可变区基因的获得
目前主要有两种方法获得抗体可变区基因，一种从抗体生产细胞中克隆；一种是从抗体库中获得。

1）从抗体生产细胞中克隆
从抗体生产细胞，如小鼠杂交瘤细胞，人B细胞等抗体生产细胞中克隆正确和所需抗体的V基因，经过研究者多年的发展并逐步改善，研究者建立一套有效的基于PCR的技术路线和方法。对于从产生单一抗体的细胞如杂交瘤细胞中克隆V区基因，目前普遍采用的是RT-PCR法，先反转录制备细胞中的cDNA，然后利用精心设计的套装引物，采用RACE(rapid-amplification of cDNA ends)的方法扩增抗体的轻重链的V区基因片段，通过电泳分离这些基因片段，克隆到相关载体后，采用测序、测定结合活性等方法进行鉴定。如何成功克隆到目标序列，最关键的是扩增抗体V基因的套装引物的设计，对于不同的抗体来说，虽然其V区基因两端的序列有可能是不同的，但经过多年的研究总结发现，各种抗体V区基因的两侧序列具有很高的同源性。通过使用多个同源性高的两端序列，并结合简并碱基的引物设计方案，设计扩增V区基因的套装引物，从而获得目标抗体的V区基因的cDNA片段。

2)构建抗体库获得抗体的可变区基因
相比传统的单克隆抗体技术相比，抗体库技术，具有库容量大、可筛选种类多、更易获得针对特定抗原表位的高活性单克隆抗体等无以替代的优势；同时抗体库技术在筛选过程中，更为省时、省力、高效、经济。目前抗体库根据其宿主免疫状态来说，主要分为天然库和免疫库两大类。天然库从理论上来说可以筛选获得可与任何抗原特异结合的的抗体，同时人抗体库可以直接产生全人的抗体V区基因，避免了后续的繁琐的人源化过程，但这些天然抗体基因缺乏体内的重排与突变过程，因而很难获得高亲和的抗体，所筛选的抗体往往需要进一步的亲和力成熟改造；同时筛选背景高，针对特定抗原的抗体丰度低。与天然库相比，免疫库中含有大量针对该特定抗原的抗体，筛选背景大大降低，并且这些抗体基因经过在宿主体内的成熟过程，往往具理想的亲和力。小鼠目前依然是最容易进行免疫和其后续进行基因工程操作的动物品种，然而通过小鼠抗体库获得的依然是鼠抗体V区基因，想使其安全用于临床，还必须进行后续的人源化改造。近两年发展的全人抗体的转基因小鼠技术，使得我们可以通过转有全套人抗体基因的转基因小鼠来制备人的免疫抗体库，并从中直接筛选具有治疗价值全人的抗体V区基因，无需人源化的改造。当然其也不是万能的，对于某些无法激活有效免疫反应的抗原，以及本身或其抗体对宿主有强烈的毒性作用来说，仍无法采用人的免疫抗体库。

2. 选择合适的恒定区片段构建基因工程抗体
目前作为人类的体内之治疗或诊断药物，基因工程抗体药物无一例外是来自人抗体IgG型各类恒定区序列。虽然V区决定了抗体的主要效果与作用，但是其通过C区介导ADCC，ADCP和CDC作用,也同时影响患者体内的基因工程抗体的药效动力学和毒理特性。人IgG型有四种类型，分别为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，除了胚系基因来源不同外，他们的最大差别体现在因铰链区结构不同引起的抗体分子的稳定性不同，以及与效应功能相关的分子（如补体C1，Fc受体）的结合特性不同。IgG1是在人类中存在最主要的IgG型抗体分子，也是目前最为被广泛采用的,绝大多数已上市或进入临床试验的基因工程抗体药物均采用人IgG1的C区。主要归因于该类型的分子不仅在体内维持双价单体的稳定的抗体分子结构，具有较长的半衰期，同时也能介导非常强的效应功能。人IgG3亚类的抗体分子也能介导非常强的效应功能，但由于铰链区较长，使得其在体内的结构不稳定，因而很少被采用。人IgG4亚类也是被经常采用的亚型类别，与FcR结合能力很弱，未与目的靶标结合的游离抗体在体内很快被清除，效应功能很弱。因此，IgG4亚类的抗体主要用于某些不希望抗体出现效应功能以及体内显像诊断领域。虽然IgG2亚类也仅具有很弱的效应功能，也有了少量的应用，但IgG2存在通过半胱氨酸链接交换形成其他的分子结构，包括形成双体分子，因此同样应用很少。

3.CDR Grafting
虽然通过将C区替换从而将异源抗体改造为含约75%人抗体组分的嵌合抗体(ChimericmAbs)，但是其V区仍有可能诱导相当强的HAMA效应。因此将V区进一步人源化势在必行。目前人源化抗体的构建方法有CDR移植、表面重塑、链替换、去免疫化等方法，其中应用最广的是CDR移植，其路线是首先对V区基因进行克隆，确定CDR区和FR区，进而通过数据库检索比对和辅助计算机分子模拟等，找出有最大同源性的人FR区模板，综合考虑、确定需要保留和改变的关键碱基，经基因合成、真核表达、检测实际结合效果后，对需要保留和改变的关键残基进行相应的修正，最终获得具有与亲本鼠单抗相同抗原表位、高亲和力的人源化抗体。其中确定CDR和FR区、需找人FR区模板、确定需要的保留和改变的关键残基是最为关键的三个步骤。通过CDR移植的方法不仅将亲本鼠的单抗与抗原结合性质赋予了新构建人源化抗体（ Humanized mAbs），并且将人源化程度提高到约95%，进一步降低其免疫原性，基本可满足要求。

一些用于人治疗应用的murine,chimeric和humanized mAbs

二、小分子抗体
目前，人源化、小型化、功能化正成为基因工程抗体药物的三大主要发展趋势。小分子抗体体因其分子量小,穿透性强,免疫原性低、可在原核系统表达及易于基因工程操作等优点而受到人们的重视,成为基因工程抗体家族的主要成员和研究热点。常见的小分子抗体主要包括Fab（由完整的轻链和Fd构成），Fv（由VH和VL构成），ScFv（单链抗体，VH和VL之间由一连接肽连接而成）及多聚体如Diabody（双链抗体），单域抗体（仅由VH组成），最小识别单位（MRU，由一个CDR组成）以及超变区多肽等多种种类型。而目前研究比较多的是ScFv抗体，Fab抗体，单域抗体等。下面我们将分别讨论这三类小分子抗体结构、性质及其特点。

一些小分子抗体的性质、特点及其应用

1. 单链抗体（singlechain Fv，ScFv）
ScFv是抗体中保留分子完整抗原结合位点的最小功能片段。其是用基因工程的手段将抗体VH和VL通过一段连接肽（linker）连接而成的重组蛋白。分子量仅约为抗体的1/6。在ScFv的分子设计上，理论上VH或VL谁在N端均可，目前尚未发现两者的位置会对其产生显著影响的规律，但一旦发现特定的ScFv结合活性大大下降，首先应该考虑更换VH和VL的位置。ScFv构建中,linker的设计往往是成功构建的关键。一般要求Linker能促进VH和VL空间折叠的形成，但又不能干扰VH和VL折叠形成空间结构过程中的抗原结合位点。这就要求Linker具有适宜的长度和柔性。一般15-18的残基的Linker长度比较适宜；Linker保持较好的柔性是为了避免影响抗原结合位点正确的空间结构，通常（Gly4Ser）3是一个较易取得成功的通用Linker。值得注意的是，如果在ScFv的C端融合其他片段，例如生物毒素，往往需要在融合片段和ScFv设计一段长度和柔性合适的间隔序列，以防止融合片段对抗原结合位点活性的影响；而在N端融合更为注意，因为N端的空间位置更为接近抗原结合位点。

2. Fab抗体
Fab抗体是一种完整的抗体片段，由重链Fd段（VH+CH1）与一条完整的轻链组成，两者之间有一个链间二硫键连接，形成异二聚体，仅一个完整的抗原结合位点。其具有弱于完整抗体分子但强于ScFv的抗原结合活性，其大小为完整IgG分子的1/3，约为55kDa。Fab抗体的一般特性与ScFv相同，区别在于Fab分子量略大，穿透力下降，且由于含有抗体恒定区，其免疫原性将上升，另外Fab更不稳定，轻重链容易解离，造成结合活性丧失。

3. 单域抗体
有的动物如骆驼的血液中不仅包含我们熟知的具有轻重链的传统抗体分子，也含有仅仅具有重链的抗体的分子，并且这些重链抗体的亲和力与传统的亲和力相当，因此这些重链抗体的单独的可变区具有很强的很强的结合能力，被称为单域抗体，因其直径2.2nm、高4nm，也被称为纳米抗体（nanobody）。骆驼科动物产生的VHH（重链抗体单独可变区）具有许多传统抗体难以媲美的优点，例如易于免疫，并可识别传统抗体已不能识别的小表位；仅具有重链且属于同一家族，因此构建文库时易于克隆且库容量很小时多样性就已很强了；天然存在，因此稳定性强、可溶性强。正因为这些优点存在，单域抗体成为一个研究的热点方向。

三、双特异性抗体
双特异性抗体（bispecific antibody，BsAb），又称双功能抗体，拥有2个不同的抗原结合位点，从而可以同时与两个靶标抗原结合，在发挥抗体靶向性的同时，介导另外一种抗体的特殊作用，例如一个结合靶标细胞上的特异性抗原，另一个结合淋巴细胞或吞噬细胞等效应细胞，从而使得效应细胞可以靶向杀灭肿瘤细胞，当然所介导的特殊功能效应分子也可以是毒素、细胞因子等。

结语：
基因工程抗体药物的出现，解决了抗体药物在以往的临床应用所面临的多种问题，使得新型的基因工程抗体药物在药效学、药动学、毒理学方面具有更为优良或是更为适宜的临床应用，为目前抗体药物的兴起奠定了重要的基础。随着分子生物学和免疫学技术的不断发展,基因工程抗体势必将会对人类的疾病的治疗等领域起到更大的促进作用。

参考文献
1. Antibody Engineering – An Update. Technical Report ,November 2016.
2. Humanization of antibodies. Front Biosci, February 2008.
3. Engineering antibody therapeutics, Current Opinion in Structural Biology, December 2017.