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如何自己制备大肠杆菌感受态细胞

前几期文章中,我们了解到了大肠杆菌转化方法(戳这里)和常见大肠菌感受态细胞的用途(戳这里)。本期为大肠杆菌转化系列的最后一篇文章,我们来聊聊如何制备感受态细胞,用于基本的转化-克隆实验。

在市场上,商家出售各种高效感受态细胞,即各种特定改造过的大肠杆菌细胞,可用于不同目的的转化;但是,一直买感受态细胞是个很费钱的事儿。所以很多实验室/研究员都会自己制作感受态细胞,以降低实验成本。今天我们就来聊聊怎么做和要注意的事情。

HOW

  • 制备100 mL 细胞悬浊液,培养基使用LB;

  • 生长至OD(600)=0.4-0.5;

  • 取出悬浊液置于冰上,同时各种接下来要用的容器也至于冰上;

  • 4°C低速离心沉淀细胞获得细胞沉淀,1500g,10 min;

  • 用10 mL TSS buffer 重新悬浊细胞沉淀,在冰上操作。

  • 分装储存于-80°C,每100 uL一份。

TSS buffer:5g PEG-3350,1.5 mL 1M MgCl2 ,2.5 mL DMSO,和LB培养基混合至50 mL,过滤灭菌后方可使用【1】

感受态细胞的转化效率可定义为每1 ug的DNA转化过后可形成菌落的数量。计算方法是数出转化后所得菌落数量,除以所用DNA的质量,计算结果的单位是colony number/ug。当转化效率可达到1×106 colony/ug 或以上的时候,这样的感受态细胞可以胜任一般的分子克隆。所以如果自制的感受态细胞可以达到这个效率,也就没有必要从商家处持续购买成品细胞了,也是节省了不少的成本和时间。虽然制备过程十分简单,但并不容易可以制作出高效地细胞,有一些注意事项供大家参考。

TIPS

  • 一定要用刚刚长出来的菌落制备细胞悬浊液;

  • 用于培养细胞的容器一定清理干净并消毒,没用任何残留的去污剂或其他异物;

  • 收集细胞时候的OD值一定要控制在0.5左右,不可过高;

  • 冰上/4°C 环境十分重要,基本上整个过程有细胞出现的地方都要低温环境;

  • 所有用来盛装细胞或溶液的容器也要先置于冰上冷却;

  • 整个过程速度要快,但是对待细胞要温柔,减少使用移液枪抽取细胞悬浊液的次数。

自制感受态细胞十分简单,你会了吗?欢迎留言讨论。

【1】Chung CT, Miller RH (1993)Preparation and storage of competent Escherichia coli cells. Methods Enzymol. 218: 621-7.

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作者: 卢阳

伦敦大学学院博士,研究方向为生物催化和细胞色素P450开发;BioEngX创始人之一。知乎主页:簏岩。



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