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拿什么拯救你-实验重复性

小编最近逛知乎遇见一个有趣的问题,“在实验室里有哪些非常容易学到的小技巧可以提高工作效率?”小编认为,效率很大程度上是由操作实验次数决定的。同样的实验,反复操作数次,结果却不一样,这很明显是效率低下的表现。但不可否认,实验重复性却是困扰很多科研人员的问题。古希腊哲学家赫拉克利特说过“人不能两次踏进同一条河流”,这句话的意思是事物是在不断发展变化的,当你第二次踏进一条河的时候,原来的水已经流走了。同样,当你第二次做同一个实验的时候,很多条件已经发生了变化,结果自然而然也就不一样了。

有些同学要说了,我两次实验的条件完全一样,但小编想说的是,完全一样是你作为操作者角度认为的,真实的EP管里是怎样的我们并不清楚(其实条件完全一样是不可能实现的,至少做实验的时间点就发生了变化)。但无可厚非,为了获得实验的重复性,尽量保证实验条件一致,是我们唯一能做的。这里的实验条件指的是什么呢?是变量。决定一个实验结果的变量太多了。我们不能确切知道每个变量对结果产生的影响,但是实验时假设所有变量都会对结果产生影响,这样谨慎的态度总是有帮助的。那么对于实验室内进行的实验有哪些可能的变量呢?知道了这些变量,又怎样保证这些变量的一致性呢?

影响实验重复性的变量

对于一个分子生物学实验来说,变量太多了,以一个PCR 反应为例子,很明显的变量有PCR管内溶液的体积,溶液的组成成分,不同成分的浓度,PCR反应的温度,反应的时间等。在我们写论文的时候这些变量是必须要清楚写明的。但是除了这些还有别的变量吗?其实还有很多。

1试剂的新鲜度

这是决定实验结果很重要的因素。食品过期了,人吃了尚且会生病。食品的保质期在包装袋上可以找到,但对于我们实验用的试剂,我们却很少能够清楚知道保鲜期。你提取了DNA质粒用来作为PCR反应的模板,这次实验用了一部分,其余的冷冻在-20冰箱里了。下一次再进行PCR反应时,你准备融化这些DNA继续当作模板。但要知道冷冻融化的过程很可能已经破坏DNA的结构。

2仪器

两台PCR仪,设置的条件一致,最终实验结果一样吗?不一定。尽管PCR仪都能进行PCR反应,但两台仪器可能生产厂家不一样?生产厂家一样,可能生产批次一样。温度设置是60度,一台仪器的实际温度可能是60.3度,一台仪器的实际温度可能是59.8度。尽管差距很小,但这可能就是影响你实验的重要条件。

3试剂生产厂家

很多厂家都会生产同一种药品,但由于不同厂家的质检标准不一样或者生产方式不一样,药品可能并不相同。同样是牛血清蛋白,为什么有的厂家生产的可以室温保存,有的却需要4度放置。同样的Pfu DNA聚合酶,你用这家的进行PCR反应没有结果,另一家的可能就会成功。因此,在你准备更换另一个厂家的产品的时候,一定要保证新的产品与你之前使用的尽可能相同。

4操作样品数量

引入误差最常见的因素之一就是一次操作样品过多。操作样品过多,很难保证所有样品处于同样的实验条件。比如,你需要提取30个质粒,即便你使用多孔道移液器也不能同时在所有EP管内同时加入P1, P2,P3。因此与其一次操作很多样品,导致实验失败,不如多花些时间,分批做,保证成功。

5其他变量

温度,浓度,体积,离心速度,离心时间这些大家都会注意到的变量小编就不在这里啰嗦了。

几个有助于获得实验重复性的技巧

1做好实验记录

实验记录一定要详细,室温不是一个好的表述,不同季节室温是不一样的,一定要注明具体是多少度。实验记录时要将你能想到的变量都记录上,这是为了以后重复实验能够保证条件完全一致,同时也是为了你在写论文时,迅速回忆起当时实验的条件

2仔细设计实验对照

对照能够让你在实验失败的时候迅速找出实验失败的原因。对照可以分为阳性对照(postive control)和阴性对照(negative control)。有关对照的重要性,小编这里想引用一段北大PhD 张浩千的表述[1]:

好的control的作用就是提高实验摸索的效率,让我们每一次实验不管成功还是失败都是带来信息量的,而不是简单的失败或者成功结果。positive control是指肯定会得到预期结果的实验对照组,比如之前自己成功过的实验组、实验组他人验证过成功的实验组或者在各方面考虑都不会出现大意外的实验组。positive control的作用主要有二,一是检查人与人之间的差异,二是检查实验环境/条件的差异。如果实验室其他人对于某个实验基本都能成功,我把这个实验接过来,用在我的实验对象上的同时也用在他的实验对象上,那么都成功了则说明这个实验技术很robust;如果他的对象成功了我的失败了,则说明有可能这个方法对于我的对象不work;如果都失败了则说明有可能是我的操作有问题。那有同学问了,如果他的对象失败了而我的却看起来成功了呢?这就是negative control的用处了。negative control的作用是评估假阳性的可能性与影响大小的。接上面的例子,如果他的对象失败了,我的对象成功了,但是我的negative control也成功了,那就说明我的对象看似成功,实则很可能是假阳性;如果我的negative control失败了,则说明很有可能是我的实验也是成功的, 只是他的实验对象我不熟悉,掌握不好,所以失败了,但是并不影响我得到阳性的结果。

3分装试剂

为了保证不同批次实验使用的试剂都是一致,一定要将试剂分装保存,尤其是不稳定的药品,蛋白质,核酸等等。这样每次实验只使用一管。另外,分装药品也方便实现不同别人公用试剂。将公用药品分装成小份分给每个人,分给自己的就不要让别人用,分给别人的自己就不要用。

4使用同一台实验仪器

前面已经谈到不同厂家生产的PCR仪效果可能不一样,小编也是最近从实验中认识到这点的。小编研究蛋白质热稳定性,需要用PCR仪给蛋白质加热,然后研究蛋白性质的变化。实验室有两台PCR仪。以前小编做实验都是哪台有空就用哪台。可是最近慢慢发现,尽管两台PCR仪设置的温度和时间是一样的,但加热效果好像并不 一样。于是最近用同样的样品,测试了两台PCR仪,结果果然发现同样的样品在一台PCR仪加热后损失的活性要高于另一台PCR仪。

5复杂实验设置关键检查点

生物化学实验内操作对象都是肉眼不可见的,对于稍微复杂一点的实验都需要设置检查点。比如在大肠杆菌内表达一个蛋白质。大概步骤是:获得DNA片段,将DNA片段插入表达载体,将重组载体转化进入宿主细胞。那么检查点至少有三个。第一个,确定是否获得了DNA 片段;第二个,确定DNA片段是否插入到表达载体;第三个,确定重组载体是否转化进入了宿主。在平常的实验中,除非对某个检查点非常有信心,可以不用进行检查,否则万不可着急。这种赶进度经常会让实验更慢。

Reference:

【1】https://www.zhihu.com/question/29096787

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作者: 于浩然

本科及硕士毕业于天津大学,博士毕业于伦敦大学学院。现就职于浙江大学化学工程与生物工程学院,PI,博导。研究方向为蛋白质工程、生物催化剂、合成生物学等。



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