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切胶回收的注意事项

在分子克隆里,大家不要小看了切胶回收(gel extraction)这一步骤,过低的DNA浓度和质量往往会直接影响后续实验的成功与否。为了避免这种不必要的事情发生,小编在此总结了一些切胶回收时的注意事项,希望能够帮助到大家。

  1. 电泳的缓冲液 (runningbuffer) 和胶(gel) 都应该是新做的,切胶的台子也要用乙醇清理干净。最好使用一次性切胶刀片,或是将刀片洗净灭菌。不要觉得小题大做,这样才可以保证切下的DNA目的条带没有外源DNA的污染。

  2. 切胶就是要把整个目的片断所在位置的胶全部回收,所以大家通常都是在条带四周划掉,然后回收。但是不要忘了胶的厚度,正面切完还要把胶立起来,再尽量切掉前后多余的部分。为了减少胶的体积,大家也可以用相对比较薄的胶来做,薄而宽的梳子来弥补点样体积不够的问题。

  3. 减少紫外线(UV light)对胶的照射时间。如果要同时切几个目的条带的话,大家可以先把胶在日光灯下分开,然后放在紫外光下逐个切掉。通常紫外光有两个波长可以选择,建议大家选择波长较长的,可以相对减少对DNA的损伤。

  4. 根据小编的个人经验,如果操作熟练,UV曝光时间短的话,DNA的序列不会发生任何变化。但是如果你还是不放心的话,也可以考虑买肉眼可见的染色剂,例如结晶紫(crystal violet)或亚甲蓝(methylene blue)。但是这些染剂与DNA的结合能力相对比较低,敏感度差,所以只能显示出大约0.5µg以上的DNA。如此一来,DNA marker就很难被染色,也就不能判断、确定目标条带的位置。在这种情况下,大家可以先跑胶,将有DNAmarker的一部分切开放到更强的染色剂里(Ethidium bromide, GelRed等),另一部分带有目的条带的放在“安全”染剂里,确定好位置,再进行切胶回收。

  5. 如果大家觉得第4条的方法有些麻烦,还想回归简单的切胶,那么也可以考虑使用一些小技巧来加快切胶的速度。例如,Gene Catcher Tips就是一个新兴的小工具,放在pipette上一吸就可以轻松把胶切下来。大家看下图就自然明白了。小编自己还没有机会尝试,也欢迎大家分享使用心得。
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  6. 相信大多数的人都在使用一些商用的gel extraction kit来回收胶。除了要遵循实验手册,大家还需要用多花一点心思来保证DNA的质量和产量。即使实验手册里没说,也可以多加一步清洗膜的步骤(washing step),这样可以进一步去除膜上离液盐的残留物(chaotropic salt residue)。否则这些残留物会影响接下来实验中连接酶(ligase)的效率。用乙醇清洗的时候,记得等到乙醇全部挥发之后,再进行洗脱(elution)。想知道乙醇是否污染了样品也很简单,可以尝试重新在胶上点样,如果在加入了loading dye之后,样品还是浮起来了,证明有乙醇污染。

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作者: 卢阳

伦敦大学学院博士,研究方向为生物催化和细胞色素P450开发;BioEngX创始人之一。知乎主页:簏岩。



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