干货 | 本期没有贺建奎，我们只讲基因编辑

前言
近期，基因编辑婴儿、贺建奎类似话题占满了新闻、微博，各大网站，但作为一个紧跟生物热点，严肃而又不失严谨的专业生物科研公众平台，合法与否、伦理问题我们暂且不谈，今天我们只讲专业——基因编辑。

基因编辑技术在经历了锌指核酸内切酶（ZFN）和转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）缓慢发展期后，在成簇的规律性间隔的短回文重复序列技术建立后，进入了高速爆发期。什么是成簇的规律性间隔的短回文重复序列技术呢？这个概念对于很多人来说可能比较陌生，但是当我写出他的英文名称时，相信大家就会吐槽小编：你这是故弄玄虚。言归正传，这个技术的大名就是CRISPR-Cas。

CRISPR是一个特殊的DNA重复序列家族，广泛分布于细菌和古细菌基因组中。CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列(repeats)组成，重复序列的长度通常21-48 bp，重复序列之间被26-72 bp间隔序列（spacer）隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。

CRISPR-Cas分类
Cas（CRISPR associated）是一种双链DNA核酸酶，存在于CRISPR位点附近，能在guide RNA引导下对靶位点进行切割。它与folk酶功能类似，但是它并不需要形成二聚体才能发挥作用。Cas基因具有多样性，根据其保守性、进化关系及操作子组成方式，可以将CRISPR-Cas系统分为TypeⅠ、TypeⅡ、TypeⅢ三种不同类型。

Ⅰ型CRISPR-Cas系统最复杂，Cas蛋白种类最多，共有6个蛋白，其中最主要的是Cas3蛋白，该蛋白具有解旋酶和核酸酶功能。多个Cas蛋白与成熟的crRNA共同结合形成CRISPR相关病毒防御复合物CASCAD(CRISPR associated complex for antivirus defense)，CASCAD与入侵的外源DNA结合，促使CASCAD内的crRNA与外源DNA的互补链配对形成R环结构，Cas3的核酸酶识别R环结构后先将互补链切开，随后在Cas3的解旋酶和核酸酶作用下再将非互补链切开。

Ⅱ型CRISPR-Cas系统主要特征是包含Cas9蛋白，参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌体DNA或是外源质粒。Cas9蛋白包含两个功能结构域，一个在N端有类似于Ruc核酸酶的活性，一个在中部有类似HNH核酸酶的活性。嗜热性链球菌具有典型的TypeⅡ CRISPR-Cas系统，它的CRISPR-Cas系统编码tracrRNA（trans-activating crRNA），其指导RNaseⅢ和Cas9完成前体crRNA的成熟。随后tracrRNA还能与成熟的crRNA的重复序列配对形成RNA二聚体，进而和Cas9蛋白结合成核糖核蛋白复合体，发挥识别和降解入侵的外源DNA功能。

Ⅲ型CRISPR-Cas系统包含Cas6蛋白聚和RAMP模块。III型系统可进一步分为亚型III-A（也称为Mtube或CASS6）和III-B（也称为聚合酶-RAMP模块）。亚型III-A系统可以靶向质粒，可能参与靶DNA的切割。III-B CRISPR-Cas系统可以靶向RNA。令人感兴趣的是，这两种III型系统似乎针对不同的DNA，这一发现需要进一步研究。

CRISPR-Cas系统作用机制
CRISPR/Cas9系统由间隔重复CRISPR基因座转录出来的pre-crRNA、多功能的Cas9核酸酶和tracrRNA组成，其中tracrRNA促进pre-crRNA的成熟，以及形成具有切割活性的crRNA-tracrRNA-Cas9三元复合体。

病毒或质粒入侵细菌后，其基因组DNA暴露于细菌胞浆之中，经过同源重组，CRISPR重复序列转录、翻译出的Cas复合物对外来DNA进行剪切，产生新的spacer序列。如果产生的新spacer序列能够与CRISPR array内部的短重复序列部分互补，将会通过某种未知的方式整合到细菌基因组的CRISPR array 序列中，从而对该病毒或质粒产生特异性免疫记忆。

CRISPR-Cas9 系统作用机制
Cas9的特异性靶点依赖于原型间隔序列3′端PAM序列，不同的Cas9突变体在基因组中拥有不同的PAM序列，来源于酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9识别一个5′- NGG-3′的PAM，而来源于嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)和脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningi-tidis)的Cas9分别识别5′-NNAGAAW-3′的PAM和5′-NNNNGATT-3′的PAM。Cas9拥有两个核酸酶结构域分别是蛋白中间的HNH结构域和蛋白氨基酸末端附近的RuvC-like结构域，其中HNH切割与crRNA互补的链，切割位点位于PAM序列上游3 bp，RuvC-like切割非互补链，切割位点位于PAM序列上游3~8 bp，从而造成双链的断裂。

CRISPR-Cas9是一种新型的分子基因编辑工具，可以对人类机体、动物和植物的DNA进行特异性的改变，该技术类似于一种特殊的分子剪刀，切割、沉默或移除特异性的DNA序列，在体内或体外用于细胞修饰，或者被直接运输到机体中来直接修饰特异性的靶细胞，如今研究人员已经在动物模型中证明了这种基因编辑工具的有效性和可用性。

CRISPR-Cas研究进展
接下来，我们将会对近期基因编辑领域重要研究成果进行综述分析。
1. 基因编辑使HIV-1调节基因表达受到抑制

CRISPR/Cas9系统为编辑HIV-1病毒基因组提供了一种新的有潜力的工具，在这项研究中研究人员设计了一种RNA引导的CRISPR/Cas9以靶向HIV-1调节基因tat和rev，其中的引导RNAs（gRNA）都基于CRISPR的特异性设计，其靶向的序列在6种主要的HIV-1亚型中都保守存在。

在共转染前每个gRNA都被克隆进CRISPRv2慢病毒中，从而创造了慢病毒载体并将之转导进入细胞。和没有转染以及转染空载体的细胞相比，CRISPR/Cas9转染稳定表达Tat和Rev的293 T和HeLa细胞后，细胞中的这两个基因表达都被成功的抑制。

2. 基因编辑的干细胞有望消除HIV

这次的研究正是通过编辑CCR5进行的基因治疗，也就是这次基因编辑婴儿事件的靶基因。CCR5基因是在2007年发现的，一位名叫Timothy Brown的HIV阳性的病人，在进行骨髓干细胞移植治疗白血病的过程中，意外的清除了他体内的HIV病毒。这可能是供体细胞的CCR5基因发生突变，因此使得这一基因成为消灭HIV的“希望之星”。

在这项研究中，研究人员利用非人灵长类动物模型，通过基因编辑技术，发现骨髓干细胞可以显著降低感染SHIV病毒的可能性，提高CCR5编辑效率可以进一步减少潜伏的感染细胞数量，预防复发。

3. 对人胚胎进行CRISPR-Cas9基因编辑会导致大片段DNA缺失
这一研究结果发表在今年8月份的Nature期刊上，研究人员为了提高靶突变的效率，使用Cas9 mRNA进行基因编辑，鉴定gRNA，通过显微注射将每个gRNA注入受精卵，结果显示98%的CRISPR-Cas9显微注射的受精卵发生了突变。然后使用与gRNA PAM序列等距的引物进一步研究发现，有45%的样本出现了较长较长片段的基因缺失（缺失的范围从800到1000bp），使用长片段的引物进行PCR，在Foxp4样本中检测到最大缺失2.3kb。也就是说，基因编辑技术并没有修复小的错误，反而产生了更大的错误。

4. 人体是否可以对CRISPR-Cas9基因编辑工具产生免疫力
如今CRISPR-Cas9基因编辑系统在基因治疗领域产生了激动人心的成果，更多的研究人员将这一工具看做治疗人类遗传性疾病的新希望，然而近期发表的一篇文章真是人类机体能对Cas9蛋白产生较为广泛的免疫力，CRISPR-Cas9基因编辑系统在临床上的应用还需要进一步的研究。

在CRISPR-Cas9系统中，Cas9蛋白来自于链球菌细菌，而链球菌感染在人类很多疾病中常见。在这项研究中，几乎所有测试的健康人受试者中都发现了与Cas蛋白反应的T细胞。这一结果可能会造成基因治疗过程中产生免疫反应，影响该技术的安全性和有效性。

5. 新研究让CRISPR基因编辑更加安全和更加精确
随着CRISPR技术的发展，为了使基因编辑更准确、更安全，科研人员也在不断的进行技术改造。近期的一项研究证明，Cas9在基因编辑效率和精确度上低于一种较少使用的被称作Cas12a（之前被称作Cpf1）的CRISPR蛋白，在人类健康和疾病中具有广阔的应用前景。

6. 官宣：义翘神州基因编辑服务正式上线了
义翘神州提供的一站式技术服务主要包括：CRISPR-Cas9基因敲除细胞系构建、CRISPR-Cas9基因敲入细胞系构建和gRNA质粒构建。服务的核心是利用成熟的CRISPR-Cas9基因编辑技术，设计高效简便的靶点，通过慢病毒系统，建立Knock-out或Knock-in细胞系，已应用于多种模式生物，包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、线虫、植物和细菌。

CRISPR-Cas9系统构建简单方便可以用于任何分子生物学实验室，因此在基础理论研究、临床治疗和农牧渔业等领域必将有越来越有广阔的应用前景，并且产生深远的影响。但是这一技术也存在不足，随着研究的深入，不仅存在脱靶效应，还可能存在其他未知的风险。

如有CRISPR-Cas9服务定制需求，可直接发送邮件至：support@sinobiological.com，会有专业工作人员与您联系。