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Km, Kcat 傻傻分不清楚?

研究酶的科研汪们都知道,无论是表达一种新酶,还是工程一个现有的酶,都需要对酶的一系列特性进行表征。小编上期已经介绍了酶的一些性质,点这里。后面小编会带大家逐渐了解如何测定酶的各种性质,不过小编毕竟水平有限,如有不当之处还请大家留言指正。这次,我们主要说说Km和Kcat。

Km、 Kcat、Vmax之间到底啥关系?我们先看上图。上图的横坐标是底物浓度,纵坐标是酶的反应速率。这个就是酶促反应动力学曲线了,可以用米氏方程来表征:

V = Vmax[S] / ( KM + [S]), 也可以写成V = Kcat[E]t[S] / ( KM + [S]),

公式中的V指反应速率,[S]是底物浓度,[E]t是酶的浓度,Km是一个常数,Kcat也是一个常数。这两个常数的意义我们后面再说。图中还有一个Vmax,这是最大反应速率,Vmax=Kcat[E]t.

从这个曲线我们可以知道,在底物浓度很低时,酶的反应速率会随着底物浓度的增加迅速增加。此时酶的活性位点的是空的,等着底物来结合,所以产物形成的速度由可利用的底物浓度决定。当底物的浓度增加时,酶的活性位点渐渐被底物饱和,此时底物形成的速率由酶的浓度决定,当活性位点被底物饱和以后,添加再多的底物都不会对酶促反应速率产生影响,此时达到最大酶促反应速率Vmax。

下面我们说Km和Kcat这两个常数:

Km(Michaelis constant,米氏常数)

Km是米氏常数(Michaelis constant),其实全称是米歇利斯常数,可能米歇利斯太难记了吧,所以大家都简称为米氏常数(为啥你们可以记住阿基米德原理,拉格朗日方程?小米同学应该会有点桑心)。米氏常数衡量的是酶与底物之间亲和力(affinity)的大小(这里指遵循米氏方程的酶)。Km等于酶促反应为最大反应速率一半时的底物浓度,其单位是mol/L,因此Km越小,表明酶进行反应所需的底物浓度越低,也可以说酶与底物之间亲和力越大。Km是一个常数,当pH,温度,离子强度不变时,Km是恒定的。

Km的重要性

Km是非常重要的参数,在酶的应用过程中,底物浓度选择常常需要参考酶Km。

1. 测定酶的活性

为了测定一个酶的活性,底物浓度应该怎么选择呢?我们通常是利用产物生成速率来衡量酶活性,在温度,pH等条件不变的情况下,产物的生成速率受到酶的活性,底物浓度的影响。我们为了测定酶的活性,自然应该使酶的活性本身作为唯一的变量,这就意味着底物的浓度必须非常高,使酶的活性位点饱和,确保酶催反应速率达到最大值Vmax。在实践中,底物的浓度常需要高出Km值的10-20倍。

2. 测定样品中底物的浓度

我们有时候会利用酶来测定其底物的浓度,比如利用荧光素酶测定ATP的浓度从而来测定细菌的数量(每个细菌内ATP数量是固定的,ATP越多说明细菌越多)。此时,我们需要保证底物的浓度是唯一的限制因素,底物的浓度必须要低于Km值,这样产物的生成速率会随着底物浓度的增加迅速提高,这就提高了检测底物的灵敏度。

Kcat

又叫转化数(turnover number),利用Vmax除以酶浓度进行计算。所以可以知道,Kcat衡量的是在最有优条件下酶催化生成底物的速率。为什么说是最优条件呢?因为此时反应速率最大(Vmax),酶的活性位点已经被底物完全饱和。Kcat是一个常数,其单位是1/s,也可以将Kcat理解成单个酶分子在一秒内转化底物的数量,或者单个酶分子转换一个底物分子所需的时间,因此Kcat也叫做转化数。

Kcat/Km

两个常数的比,当然也是一个常数。Kcat与Km的比是衡量一个酶催化效率的最重要参数。Kcat越大,Km越小,二者的比值越大。Kcat越大说明酶转化底物的速率越快,Km越小说明酶与底物之间亲和力越大。当酶有多个可利用的底物时,其对不同底物的催化效率可能差别很大。Kcat/Km就可以用来确定酶的最适底物,同一个酶对不同底物的Kcat/Km最大可相差100万倍。当利用蛋白质工程对酶进行改造时,不同突变型的Kcat/Km也是需要要测定的参数,用来表征酶催化效率的变化情况。

呀!不知不觉又写了这么多。Km,Kcat这么重要,应该怎么测量呢?等待小编的下篇文章吧。

 

作者: 于浩然

本科及硕士毕业于天津大学,博士毕业于伦敦大学学院。现就职于浙江大学化学工程与生物工程学院,PI,博导。研究方向为蛋白质工程、生物催化剂、合成生物学等。



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