Nat.Commun. | 嵌合体翻译系统的定向进化，可用于高效的整合非天然氨基酸以及营养缺陷型菌体的构建

2021年12月，浙江大学林世贤团队在Nature Communications发表题为“Directed-evolution of translation system for efficient unnatural amino acids incorporation and generalizable synthetic auxotroph construction”的文章。

该研究对嵌合体苯丙氨酸tRNA的受体臂和嵌合体苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶进行了系统的定向进化，极大地提高了含非天然氨基酸 (unnatural amino acids，UAA) 蛋白的产量（图1）。定向进化后的嵌合体翻译系统能够在模型蛋白的单点和多点允许UAAs以接近天然氨基酸的效率编码。利用嵌合体翻译系统，构建了一系列严格依赖外源UAA供应生长的大肠杆菌营养缺陷型菌株，研究进一步证明，该菌株可以在活体小鼠中茁壮生长。

图1 嵌合体翻译系统的工作原理与应用

以 WT（chPheT）为例（图2），研究人员首先对chPheT的受体臂的第2 ~ 7个碱基对开始系统的定向进化，碱基被随机分配到所有可能的组合中，生成约1.7 × 10⁷个变体的文库，随后的tRNA文库经过一轮的正筛选（筛选1800个克隆），测序200个荧光信号明显强于WT组的克隆，结果显示，这些新进化的正交tRNA的受体臂有一些共同的特征，都使用U-A作为第二碱基对和G-C为第七对碱基对。最活跃的3C11-chPheT, 在AzF存在时活性增强6.3倍。

图2 chPheT的定向进化

苯丙氨酸氨酰-tRNA合成酶的定向进化采用了多轮易错PCR的方法，对AzFRS-1的C-末端结构域进行进化，13万多个克隆经4轮筛选最终获得了12D4-chPheRS和13E3-chPheRS两个优势克隆。

图3 chPheRS的定向进化

其中12D4-AzFRS-1的效率比前体chPheRS高6.2倍，13E3-AzFRS-1的效率高5.6倍，并且它们有几个共同的突变 (图3a)。这些突变都没有出现在氨基酸结合袋中，这表明这些突变可以转移到其他chPheRS中，从而有效地识别各种UAA (图3 b)。分析显示，12D4-chPheRS/3C11-chPheT对能够在蛋白的多个位置和多种功能蛋白质中以接近天然氨基酸的翻译效率编码多种非天然氨基酸（图4）。

图4 非天然氨基酸在多个位置和多种功能蛋白质中的引入

最后，该研究筛选了所有可用的chPheRS/3C11-chPheT对，找到了在AzF存在时琥珀密码子抑制效率提高了65倍以上的理想突变，成功构建了合成营养不良菌的理想系统（图5）。研究进一步证明，依赖于外源性 UAA 的体内供应，营养缺陷型菌株可以在活体小鼠中茁壮生长。进化的系统将极大地扩展我们生产功能蛋白、构建生物安全实验室菌株和减毒疫苗开发的能力。

图5 非天然氨基酸依赖的大肠杆菌的构建

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-27399-x