2022年4月，德克萨斯大学奥斯汀分校Andrew D. Ellington团队和Hal S. Alper团队共同在Nature上发表题为“Machine learning-aided engineering of hydrolases for PET depolymerization”的文章。
聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）俗称涤纶，被广泛用于纺织业和塑料制品，占全球固体废物的12%，理论上可以通过PET水解酶对PET的快速解聚实现碳循环，然而大多数PET水解酶仅在高反应温度（约70℃）和催化高度加工过的底物时才显示出明显的水解活性。其中PET同化细菌Ideonella sakaiensis（PETase）可以在环境温度下进行水解但非常不稳定，其具有两个热稳定性和催化活性均有改善的工程化突变体——ThermoPETase和DuraPETase。
本文使用基于结构的三维自监督卷积神经网络（CNN）机器学习模型Mutcompute（https://mutcompute.com）来设计PETase，这是一款只需要提交PDB ID就可以进行预测和可视化的在线软件。作者使用WT PETase和ThermoPETase进行预测并将预测结果渲染到晶体结构上（图1a），然后根据相对于野生型的性能变化对预测结果进行排序（图1b）。研究使用逐步组合策略总共构建了159个单点和组合突变体，进一步表征这些突变体的催化活性和热稳定性，四个突变（S121E、T140D、R224Q和N233K）无论单点还是组合均导致了催化活性和热稳定性的提升，因此用于进一步的研究。
图1 机器学习引导酶性能提升流程
作者将WT PETase、ThermoPETase和DuraPETase作为模板引入以上四个突变的所有组合，由于ThermoPETase和DuraPETase中已分别有S121E和T140D两个突变，且有两个组合无法在DuraPETase中纯化，故共有27种可能的组合突变体被用于热稳定性分析。其中23个突变体的Tm相对于出发酶蛋白有所提升，DuraPETaseN233K是迄今为止热稳定性最佳的PETase（Tm为83.5℃），所有27个突变体的蛋白质产量均得到了提升，证明了MutCompute可预测更稳定突变体的能力。
图2 水解活性热图
作者分析了FAST-PETase的晶体结构来解释稳定性增强的原因。S121E突变与H186和N172形成新的水介导的氢键网络（图3（ii））；R224的侧链突变为谷氨酰胺时，与S192的羰基形成氢键（图3（iv））；N233K突变将带正电荷的赖氨酸置于E204旁边并建立了分子内盐桥（图3（vi））。
图3 结构比较
接下来，作者研究了基于机器学习的预测的可迁移性和普适性。作者选取了N233K突变，将类似的赖氨酸突变引入到叶枝堆肥角质酶（LCC）、LCCF243I/D238C/S283C/N246M（ICCM）和来自绿色糖酵母AHK190的类角质酶Cut190中。产生的赖氨酸突变体LCCD238K和Cut190D250K表现出热稳定性的提升（图4a），三种赖氨酸突变体在无定形PET薄膜上的水解活性都显著高于它们各自的野生型（图4b）。
图4 赖氨酸突变体的热稳定性和水解活性比较
之前的水解活性测试是在实验用的PET薄膜上进行的，而验证PETase对未经处理的塑料产品的性能至关重要。在50℃下用FAST-PETase对商店购买的51个塑料产品进行处理。尽管这些原材料在结晶度、分子量、厚度和添加剂方面存在差异，但打孔取得的样品在24小时到1周的时间内都被FAST-PETase完全降解（图5）。
图5 FAST-PETase水解不同来源塑料所需时间
以豆饼盒为例分析其随时间的变化，在FAST-PETase催化的16个小时里豆饼盒的质量几乎是呈线性衰减并且结晶度从1.2%增加到了7.7%，而其他酶的水解活性明显低于FAST-PETase，即使与LCC和ICCM在最佳反应温度下（72℃）的活性相比，FAST-PETase在50℃的活性仍分别比二者高4.9倍和1.5倍（图6）。使用原子力显微镜（AFM）以及扫描电子显微镜（SEM）进一步展示FAST-PETase的反应过程，随着水解的进行，PET表面产生越来越深、越来越大的孔，这导致在反应过程中表面粗糙度和不透明度不断增加（图7）。
图6 不同水解酶随时间对豆饼盒的水解过程
图7 PET薄片随时间的AFM图像
以上水解活性测定对象均为打孔的PET薄片，对于未经处理的大型塑料片，只需增加净反应体积便可轻松水解（图8）。与热成型的塑料产品不同，水瓶是通过吹塑生产的，在膨胀过程中会产生高度结晶的部分，导致瓶子各部分的结晶度不同（图9a），因此在不同的部分进行切片或打孔取样并在50℃下用FAST-PETase处理24小时。结果表明，在瓶口/颈部和底部中心区域有大量单体释放，而在瓶子的其余部分仅释放了微量单体，证明高结晶度会抑制酶解聚速率（图9b）。PET在70℃下会更具柔性，尝试用嗜热酶LCC和ICCM对PET进行水解，但无论在什么温度下，高度结晶的部分均不能被有效解聚。为了使瓶子能够被完全降解，作者对瓶子进行了热预处理，使瓶子变得均匀无定型，然后使用预处理过的瓶子的打孔薄膜进行水解活性测定（图9c），结果表明其可以被FAST-PETase有效解聚。对于完整的预处理的水瓶，FAST-PETase也可在不到2周的时间内将其基本完全降解（图9d）。
图8 大型塑料片水解过程
图9 塑料瓶的水解
除了塑料产品，PET还大量用于合成纺织行业，因此对五种不同的商业聚酯产品在50℃下用FAST-PETase处理，FAST-PETase为在纺织物中回收PET单体和减少微纤维进入环境提供潜在途径（图10）。
图10 商业聚酯的水解
最后，研究尝试了利用所获得酶突变体进行PET完整闭环回收过程。PET解聚只是循环塑料经济的一半，使用PETase解聚有色塑料，然后回收单体并重新聚合成透明的原始PET，将具有极高的工业价值。文章报道，使用FAST-PETase解聚有色塑料，回收的TPA单体产率能达到94.9%，纯度超过97%，然后利用所回收的TPA重新合成了原始PET，形成了完整的闭环PET回收过程（图11）。
图11 闭环的塑料回收过程
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41586-022-04599-z
