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PCR进化,超进化,究极进化~~~

無限大な夢のあとの

何もない世の中じゃ

仅以Butter-fly的一句歌词开始今天的文章,纪念去世的原唱,和田光司。小编并不是他的粉丝,只是数码宝贝主题曲,勾起了无限多的童年回忆,谁还没迷过一两部动画片呢^_^。时常想起进化、超进化的数码宝贝,和正义战胜邪恶的故事。


——————————这是分割线,好硬的转折>_<————————


PCR也是可以进化的

作为分子生物学最最基础也并不简单的实验过程,PCR让我们有机会扩增一段特定的DNA片段,有了分析单个基因的条件。PCR要发生非常简单:一个母板DNA,一个正向(上游)引物,一个反向(下游)引物,一种DNA复制酶,一堆dNTP作为复制原料,和适应酶工作的缓冲液环境,以及一个设置好的温度循环。但有时候现实中的PCR并不是这么简单就可以完成的,总会出现各种让人苦恼的问题。为了达到不同的扩增目的、提高扩增效率或是增加检测能力,各种以PCR为理论基础的进阶版PCR被使用。在本期文章中,小编先介绍一下各种进阶PCR的概念,后续文章我们再详细说说每种PCR的使用方法。

Colony PCR

菌落PCR,一个快捷验证质粒/特定基因片段是否存在于细菌中的方法。如果按照传统的分子生物学的步骤,我们想要验证一段基因已经成功克隆到细胞中,那么一般要经历养细胞>提取质粒>送测序/酶切验证等等这些步骤。但是这太费时间了,于是人们直接把菌落拿出来作为DNA母板,使用目标基因的正反向引物,进行PCR。在菌落PCR之前,重要一步是将菌落“煮熟”,否则细菌细胞内的有活性的蛋白质可能会影响到DNA复制酶的正常工作。小编经常用,效果还不错!

Hot start/cold finish PCR

改造过的DNA复制酶,只在高温环境下才会被激活,所以阻止了稍低温度下可能出现的非特异性扩增。

Nested PCR

巢式PCR,其实就是两轮PCR反应,其目的是提高最终目标片段的特异性扩增。不同于普通PCR,巢式PCR需要两对引物。第一对引物用于扩增包含目的片段的较长片段,这个较长片段就是所谓的巢,第二对引物用于扩增目的片段,原理如下图所示。通过第一轮PCR调高了“巢”片段的数量,相当于提高了第二轮PCR母板的纯净度,因此也更容易扩增目标片段。

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Quantitative/Real-Time (q) PCR

这就是传说中的qPCR了,又叫即时PCR,简单来说就是,一边进行着正常的PCR反应,一边可以告诉我们到底有多少目标片段被复制出来了。荧光标记的扩增片段可以在每轮扩增后被定量检测出来,一次给我们一个准确的扩增总量。关于qPCR,我们有太多可以讨论和延伸的,比如如何设计引物,如何分析数据,这些我们以后再说咯~

Splicing by overlap (SOE) PCR

想把两段DNA片段连接起来,最简单最传统的方法是酶切-粘合的方法,除此以外还可以用PCR的方法,设计使两段DNA片段的末端拥有一小部分重合的序列,在进行正常的PCR反应的时候,两个片段可以互为引物,最终扩增成一条结合在一起的片段(具体内容见往期文章,把DNA变成乐高玩具,想怎么拼就怎么拼!)

Touchdown PCR (TDPCR)

Touchdown PCR又叫降落式PCR,降落的是退火温度(annealing temperature)。TDPCR的前几个循环拥有较高的退火温度,每个循环都降低一点,逐循环下降,直到降低至你设计的退火温度。在高退火温度的时候,会积累一些特异性产物,后期退火温度下降到适宜的位置,这些特异性产物的扩增效率会增加,因此减少了非特异性扩增。


有关进阶版的PCR,还有哪些,欢迎留言讨论哦!

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作者: 卢阳

伦敦大学学院博士,研究方向为生物催化和细胞色素P450开发;BioEngX创始人之一。知乎主页:簏岩。



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评论列表(1)

  1. 请问Splicing by overlap (SOE) PCR 和Gibson assembly 的区别是什么呢?

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