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PCR反应中各种添加剂的作用(上)

相信大家在做PCR反应时总能遇到这样或是那样的问题,但多数都可以归为两个主要原因:

  1. 基因模板的扩增太少(amplification);
  2. 非目标基因扩增太多。

但是大家可以使用添加剂来解决这些问题。通常添加剂的作用有两方面:

  1. 降低基因的二级结构(secondary structure);
  2. 降低非特异性的启动(priming)。

今天小编就会简单给大家介绍一下PCR反应中常见的添加剂以及它们的作用。

降低二级结构的添加剂

二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)

DMSO可以降低DNA的二级结构,所以通常在扩增GC含量很高的基因样本的时候都会添加。但是,DMSO 也会大大降低Taq 聚合酶(Taq polymerase)的活性(activity)。所以,大家要权衡好模板的接近率(template accessibility)和聚合酶的活性。小编建议大家可以尝试不同的DSMO的浓度,例如从2% 到10%,来找出适合自己实验的浓度。

非离子性洗涤剂(Non-ionic detergents)

非离子性洗涤剂,例如0.1-1% 的Triton X-100, Tween 20 或是NP-40,通常可以降低DNA二级结构。虽然这样可以增加模板基因的扩增,但也会带来非特异性扩增的困扰。所以,这些添加剂对无杂物低产量的PCR反应很管用,但对相对不太纯的PRC反应就没那么好了。非离子性洗涤剂的另外一个好处就是可以减少SDS 污染。通常在DNA提取过程中,SDS会被带到PCR这个步骤,这就大大抑制了聚合酶的活性。所以,反应中加入0.5% 的Tween-20 或是Tween -40 可以中和SDS带来的负面影响。

甜菜碱(Betaine)

甜菜碱可以通过减小二级结构的形成来提高DNA的扩增,并且一般是商用PCR kit的“神秘”添加物。如果大家要用甜菜碱的话,应该放甜菜碱或是一水甜菜碱(Betaine or Betaine mono-hydrate),但不是盐酸甜菜碱(Betaine HCl), 调成最终浓度为1-1.7M 的浓度。甜菜碱还可以帮助提高特异性,因为它能消除DNA融化/变性时对碱基对的依赖(eliminate the base pair composition dependence of DNA melting/DNA denaturation) 1。

Reference:

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8418834

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作者: fiofiona

伦敦大学学院博士,研究方向VLP生产,微藻的基因工程



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