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如何使用Primer5进行引物设计

质粒构建第一步就是设计引物。首先大体了解一下引物设计的一些通用原则:
1. 引物长度一般在15~30 bp,最常用的是18~27bp;
2. 引物GC含量在40%~60%之间,Tm值最好在72度℃左右。Tm值简单粗暴的计算方法为Tm=4×(G+C)+2×(A+T),或在此基础上减5度;
3. 引物3’端不能选择A,最好选择T,G/C的错配率介于A/T之间;
4. 以上为最主要的原则,另外还要注意引物的特异性、引物内部不能形成二级结构等原则,具体可以百度之;

当然以上原则并不一定非要完全符合,但是作为一个新手而言初期最好是严格遵守为妙。下面介绍如何利用Primer5设计出满意的引物
1. 如下图,首先点击File->New->DNA Sequence

2. 点击空白处Ctrl+V粘贴我们的CDS序列,选择As is,即我们复制的是什么样的序列就粘贴的什么样的序列。下面的依次是“反向序列粘贴”、“互补序列粘贴”“反向互补序列粘贴”。

3. 点击左上角的Primer,如下图,S=Sense(上引),A=Antisense(下引)

4. 如果对现在的引物不满意,还可以点击Edit Primers编辑序列,如下图,我们删除掉末尾三个碱基,之后需要先点击Analyse,然后才能点击OK,我们可以看到正向引物已经从25个碱基变为22个碱基了。

最后点击Edit->Copy->Sense Primer,粘贴到Word中即可得到正向引物,反向引物Copy之后粘贴也会自动变为5’到3’的序列。所以非常方便,Primer 5还有很多强大的功能,大家可以自行探索。

作者: SciRes

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