QuikChange定点突变方法简说

定点突变技术是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法对DNA片段中特定位置碱基进行替换，删除或添加新的碱基的技术。体外定点突变技术是当前生物，医学各领域研究中的一种重要的实验手段，能够用来探究蛋白质结构与功能之间的关系，优化基因表达，改造载体等目的。小编今天为大家介绍一种常用的体外定点突变的方法，QuikChange Site-directed Mutagenesis。

QuikChange方法以质粒作为模板，经过PCR反应，Dpn I 酶切和转化三个步骤，能够在一天内完成定点突变实验。当然在实验以前，我们需要设计包含有目的突变点的引物。下面小编将简单介绍引物设计，PCR反应，Dpn I 酶切以及转化这几个步骤。详细内容可参考Agilent QuikChange II XL Site-Directed Mutagenesis Kit 手册。

引物设计

引物应该是一对互补的寡核苷酸链，其中含有目的突变位点。引物长度在25-45碱基之间， 引物的Tm值要大于78 oC，长于45个碱基的引物将有可能形成引物二聚体，从而影响突变反应的效率。目的突变点应该位于引物的中间位置，突变位点两侧各有10-15个与模板一致碱基。另外引物的GC含量至少应为40%， 并且有至少一个G或C碱基位于末端。小编推荐利用Agilent官网中的软件来设计引物，www.agilent.com/genomics/qcpd

PCR 反应

PCR反应需要考虑两个方面：一个是PCR反应体系，另一个是PCR反应条件。在设计PCR反应体系时，需要注意的是引物的浓度。反应体系中引物需要过量，通常一个50 μL的反应体系内应该含有超过125g的引物。在首次尝试设计反应体系时，可以加入10 ng的质粒模板，如果反应没有成功，需要优化模板的用量，范围应该在5 ng-50 ng之间。设计PCR反应条件时，常选择5 min的延伸时间，18个循环。循环数大于18， 将有可能引入非特异突变。

Dpn I 酶切

Dpn I限制性内切酶用来降解甲基化的模板DNA以避免后续转化可能导致的假阳性克隆。通常情况下，50 μL反应体系在中加入1 μL Dpn I酶，37 oC放置1 h 即可消除模板DNA。

转化

Quikchange方法的好处是不需要进行再次克隆，可以直接将Dpn I酶切的产物转化进入大肠杆菌的感受态细胞中。转化采用常规的热激方法即可。转化后平板需要在培养箱内放置不少于16 h。最后挑选阳性克隆，测序进行验证。在实验过程中，可能会遇到各种问题，比如转化效率很低，突变效率不高，出现假阳性克隆等等，详细解决对策可点击本链接。

图片来自网络，内容由BioEngX原创，转载请注明！

扫描下方二维码关注BioEngX官方微信公众平台