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实验 | RNA提取实验中的那些玄学

当年还是新手的时候,曾经在网上读过不少关于提取RNA心得体会的文章。如今从事科研已经十年有余,现在回过头再去读那些文字,就会发现其中不少“经验”仅是“玄学”。这篇文章将破除一些迷信。

一、什么方案都比不过说明书

对于提取RNA的新手来说,无论是打算用试剂盒还是用Trizol法,首先需要阅读的是说明书,而不是网上的经验文(对,包括我这一篇)和实验方案。良心的试剂厂商在销售产品之前,会对其使用方案进行反复测试。因此,说明书中所提供的实验步骤,才是最准确的。

二、经典Trizol法并不能获得总RNA

这个事实可能会刷不少新手甚至老手的三观,但确有实验支持:经典Trizol法会选择性丢失低GC比的miRNA。这一点,源自一则作者自撤稿的故事。

V. Narry Kim是韩国鼎鼎大名的美女科学家,专做RNA相关的研究,包括miRNA。几年前她们组发现一个奇怪的“现象”,即贴壁细胞在消化之后,会有一些miRNA的丰度突然降低,看起来好像是被快速“降解”掉了,并据此写了一篇文章发到Molecular Cell上。但很快她们就发现,这个“现象”难以重复:如果用Trizol做实验,就一定是阳性结果,而用试剂盒提RNA,就重复不出来。难道是号称能提总RNA的Trizol方案出了问题?确实如此。

经进一步实验后发现,经典的Trizol方案会使得低GC比的miRNA丢失。如下图实验中,她们在不同总量或者说浓度的总RNA中,混入20 fmole的miR-141和miR-200c。然而,在总RNA量少的情况下,GC%比较低的miR-141,提取出来的相对浓度就会低于miR-200c。但这也不是说,Trizol法就完全不能用了。她们组还发现,在Trizol中加入10 mM的MgCl2,可以解决选择性丢失低GC比小RNA的问题。最后,V. Narry Kim写信给杂志社编辑部,要求撤除之前的文章。

试剂盒法,同样也是得看柱子是否支持抽提小RNA。目前市面上有仅富集小RNA、丢弃小RNA仅纯化大RNA,以及提取总RNA三种。总之又回到第一点,先看说明书,读完再动手。

三、对实验环境的要求并没有想象中那么苛刻

我在小本的时候曾去过某实验室实习,发现他们有专门的一个小隔离空间来提RNA,进去还得戴口罩。网上也有许多文章说,RNase很恐怖,所以到处都要擦得bling bling才能做实验。甚至还有许多试剂厂商推出了专门用来擦桌子的喷雾……对,RNase可怕这一点并不假,但也没有网上说得那么夸张,好像空气中弥漫的RNase都能榨出汁来的样子。

我本人提了那么多年RNA,从来就不用那些很夸张的措施。穿好实验服戴好手套,保护好自己就好。口罩爱戴不戴,反正我从来不戴。做实验时高冷一点,不要指点江山、口沫横飞即可。对了,勤换手套,甚至离一次心换一次的,也是玄学。

四、醇沉淀不是越多就越好

有些实验方案会推荐,在异丙醇沉淀后,用乙醇沉淀两次。实际上,任何提取实验,都会在纯度和得率这一对矛盾中取舍。醇沉淀会将脂溶性杂质去掉,但部分非脂溶性的杂质依然会连同RNA一起被沉淀下来。因此,多整几次,并不会让RNA的纯度翻倍,反而还会有降低得率的风险。一般情况下,异丙醇和乙醇各沉淀一次即可。但是,倘若预计RNA浓度很低,那就只能放弃纯度,在低温沉淀数小时,以换来较高的得率。

五、围绕DEPC的玄学

许多实验方案会推荐使用0.1% DEPC处理RNA相关用水,以灭活RNase。这一点是要肯定的。不过,在使用DEPC的过程中,又充斥着一些玄学。

首先,高压灭菌后的DEPC水,会有一股“香甜”的味道。许多人会以为那是残留的DEPC而不敢用。实际上,这只是DEPC分解成CO2和乙醇后,产生的一些挥发性酯类副产物。

其次,单纯高压过的蒸馏水或超纯水,基本可以视为无核酸酶活性等级的水。Thermo Fisher公司曾经做一项实验来说明这个问题。

(来源https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/ambion-tech-support/nuclease-enzymes/tech-notes/rnase-and-depc-treatment.html

如下图所示,在PBS中加入不同浓度RNase A,高压或不高压,后溶解P-32标记RNA 探针。最后数据显示,除非原始的RNase A的浓度高达1 µg/ml,否则常规高压过的水,基本检测不出RNase A活性。当然,Thermo的科学家也很谨慎,说这个结论仅适用于RNase A,不能推广到其他的RNase类型。

目前,我本人不使用DEPC来处理RNA实验相关试剂和耗材,因为太费劲,而且DEPC还有毒性。相关的液体试剂,我会使用从公司购买的Nuclease-free的水来配制。没有很贵,一小瓶够用很久。很多时候买各种其他试剂,比如酶、siRNA等,也都会送这样的水。在耗材方面,直接使用大公司的离心管和吸头,根本不用担心核酸酶的问题。

最后要注意的是,DEPC并不是万能的,尤其是无法处理含有Tris、HEPES等含胺类的溶液,除非加到很高的浓度。

作者: bio-dog

生物医学科研工作者吴思涵的个人平台,专注生物医学干货输出。搜索微信公众号bio-dog同时关注。



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