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怎样避免表达纯化的重组蛋白有“毒”?

好不容易完成一个重组蛋白的表达纯化,结果却内毒素含量超标,这可该怎么办啊?

首先我们需要知道,内毒素是什么东西?为何会影响重组蛋白的使用呢?

内毒素(Endotoxin)是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构。细菌在生活状态时不释放,只有当细菌死亡自溶或粘附在其他细胞时,才表现其毒性,主要由多糖、脂质和蛋白质组成复合体。内毒素直接作用于人体,激活组织内的炎性细胞和炎症因子,导致机体发热并引发全身性炎症反应,继而引起弥散性血管内凝血、休克、多脏器功能衰减等。

内毒素会与细胞膜上的受体结合引起免疫反应,对细胞有较强的毒性作用,从而影响体内或体外细胞的生长和功能。因此,在免疫学实验、细胞培养实验、细胞治疗、细胞凋亡研究以及干细胞培养与扩增分化中,使用到蛋白因子都需要低内毒素。在细胞因子功能分析、蛋白相互作用等研究中也必须使用低内毒素的重组蛋白。以重组蛋白作为抗原,生产高质量的抗体更是需要低内毒素的重组蛋白。

内毒素超标,会严重影响重组蛋白的使用,怎样操作才可以避免呢?

首先,在蛋白的表达纯化过程中要使用注射用水,尽量减少内毒素的产生。在重组蛋白制备过程中,所有用到的缓冲液、液体试剂、培养基等均用注射用水配制,防止引入内毒素。

制备注射级用水设备

其次,选择原核表达系统以外的平台,比如CHO稳定细胞株表达平台、HEK293稳定细胞株表达平台、昆虫杆状病毒表达平台及酵母细胞表达平台。内毒素大多是原核细菌产生的,避免原核表达系统,可以减少重组蛋白产品的内毒素含量。

低内毒素表达系统

第三,高通量亲和纯化系统,本身就是一种去除内毒素的理想方法。在蛋白纯化过程中,采用亲和层析过柱法,极大的降低了产品的内毒素含量。

亲和层析纯化系统

第四,GMP生产线,整个制备过程无菌,使得重组蛋白的内毒素含量低于低于0.01EU/ug。

低内毒素GMP车间

如果制备的重组蛋白内毒素超标了,还是有办法“拯救”的,可以选择超滤法或亲和层析去除。

内毒素去除方法

 

作者: 义翘神州

北京义翘神州科技股份有限公司是一家从事生物试剂研发、生产、销售并提供技术服务的生物科技公司,主要业务包括重组蛋白、抗体、基因和培养基等产品,以及重组蛋白、抗体的开发和生物分析检测等服务,为全球的药品研发企业和生命科学研究机构提供高质量的生物试剂产品和高水平的技术服务。义翘神州的产品能够覆盖生命科学研究的多个领域,为分子生物学、细胞生物学、免疫学、发育生物学、干细胞研究等基础科研方向和创新药物研发提供“一站式”生物试剂产品和技术服务。



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