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技能篇 | IHC之路漫漫（上篇）

发布: 2019-01-09 55阅读 82评论

路漫漫其修远兮，吾将上下而求索。
一入科研深似海，从此自由是路人。

在实验室待的越久，越感觉自己知道的少，实验顺利还好，如若遇到不能出现预期结果，都不知道哪里出了错。做免疫组化实验室时，更是迷惘。。。

免疫组化IHC实验应用广泛，是当前免疫研究常用的实验方法之一，尤其是在发表SCI文章时，一张完美的IHC图片顿时让论文上升一个Level。

义翘IHCCT026-R301-CD3-癌旁扁桃体-4X

曾有人说过一个IHC实验可有480万种分析解决方法，那接下来我们就一起来扒一扒哪些在IHC实验过程中的不同阶段遇到那些坑。

IHC实验步骤

1. 免疫组化实验结果如何分析？

义翘CT026-R301-CD3-结肠芯片IHC结果图

（1）阳性着色细胞计数法：在40倍光镜下，随机选择不重叠的10个视野，人工或机器计数阳性着色细胞，每组3-6张不同的动物组织切片，然后进行组间比较；
（2）定量分析法：在免疫组化实验中，阳性着色的深浅和面积的大小与蛋白质含量相关，因此可以根据图像的光密度和灰度进行定量分析。常用的有光密度法和灰度法。两者都需要利用不同的分析软件对阳性结果进行分析。
（3）评分法：不同的靶点评分标准会有差异，但大多数会按照如下方法进行分级：在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度（0~3分分别为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色）、阳性范围（1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%）进行评分，最终可以分数相加或相乘，再进行比较。
对于以上几种方法，各有利弊，需要根据实验目的进行选择。当然进行分析的前提是要获得着色均匀、背景较浅的高质量切片。

2. 是否需要使用Triton X-100？

Triton X-100结构图

Triton X-100是一种去污剂，可作为细胞通透剂，在膜上打孔。
作用原理：溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子物质进入胞浆和胞核内。在做厚切片免疫组化时会使用，可使抗体顺利进入胞内与相应抗原结合。

3. 内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度选择
（1）一般3% H2O2灭活时间短，10min左右；而0.3% H2O2可适当延长封闭时间， 10~30min；
（2）用甲醇配置的H2O2比双蒸水或PBS配置的在保护抗原和固定组织作用上更好一些，此外H2O2孵育时间过长易引起脱片；
（3）现用现配，配好后4℃避光保存。

4. 如何才能充分脱蜡？
（1）脱蜡不干净
切片上有残留，会产生染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难辨、背景染色增加等后果。
目前用于脱蜡的试剂效果最好的是二甲苯，脱蜡力强，且时间短，但由于其有一定危害性，近年来无毒环保脱腊液的使用也越来越多。
（2）脱蜡的时间要根据季节、室温和试剂的新鲜程度作出调整
夏季，室温较高， 3-5分钟；冬季，室温较低，10-20分钟或更长。
若脱蜡剂陈旧则需要适当延长脱蜡时间。
（3）切片带有温度进行脱蜡，可加速脱蜡过程
如果预先切烤好的切片，在染色前对切片进行加温10-20分钟，再行脱蜡，这样脱蜡速度加快，效果更好。

5. PBS的清洗方式、次数和时间的选择？
（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染
（2）温柔冲洗，防止切片脱落
（3）有足够冲洗时间，才能彻底洗去结合物
（4）PBS的PH和离子强度有严格要求：中性及弱碱性条件（PH 7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则易于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，高离子强度则易分解。
免疫组化目前常用PBS PH在7.2-7.4，浓度0.01M。

6. 一般在什么情况下进行组织抗原修复？
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而失去抗原性。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率。
修复方法从强到弱分为三种：高压修复、微波修复、胰酶修复。

未完待续。。。

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