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技能篇 | IHC之路漫漫(上篇)

路漫漫其修远兮,吾将上下而求索。
一入科研深似海,从此自由是路人。

在实验室待的越久,越感觉自己知道的少,实验顺利还好,如若遇到不能出现预期结果,都不知道哪里出了错。做免疫组化实验室时,更是迷惘。。。

免疫组化IHC实验应用广泛,是当前免疫研究常用的实验方法之一,尤其是在发表SCI文章时,一张完美的IHC图片顿时让论文上升一个Level。

义翘IHCCT026-R301-CD3-癌旁扁桃体-4X

曾有人说过一个IHC实验可有480万种分析解决方法,那接下来我们就一起来扒一扒哪些在IHC实验过程中的不同阶段遇到那些坑。

IHC实验步骤

1. 免疫组化实验结果如何分析?

义翘CT026-R301-CD3-结肠芯片IHC结果图

(1)阳性着色细胞计数法:在40倍光镜下,随机选择不重叠的10个视野,人工或机器计数阳性着色细胞,每组3-6张不同的动物组织切片,然后进行组间比较;
(2)定量分析法:在免疫组化实验中,阳性着色的深浅和面积的大小与蛋白质含量相关,因此可以根据图像的光密度和灰度进行定量分析。常用的有光密度法和灰度法。两者都需要利用不同的分析软件对阳性结果进行分析。
(3)评分法:不同的靶点评分标准会有差异,但大多数会按照如下方法进行分级:在光学显微镜下对组织切片分别按染色程度(0~3分分别为阴性着色、淡黄色、浅褐色、深褐色)、阳性范围(1~4分为0~25%、26~50%、51~75%、76~100%)进行评分,最终可以分数相加或相乘,再进行比较。
对于以上几种方法,各有利弊,需要根据实验目的进行选择。当然进行分析的前提是要获得着色均匀、背景较浅的高质量切片。

2. 是否需要使用Triton X-100?

Triton X-100结构图

Triton X-100是一种去污剂,可作为细胞通透剂,在膜上打孔。
作用原理:溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子物质进入胞浆和胞核内。在做厚切片免疫组化时会使用,可使抗体顺利进入胞内与相应抗原结合。

3. 内源性过氧化物酶的灭活时间和浓度选择
(1)一般3% H2O2灭活时间短,10min左右;而0.3% H2O2可适当延长封闭时间, 10~30min;
(2)用甲醇配置的H2O2比双蒸水或PBS配置的在保护抗原和固定组织作用上更好一些,此外H2O2孵育时间过长易引起脱片;
(3)现用现配,配好后4℃避光保存。

4. 如何才能充分脱蜡?
(1)脱蜡不干净
切片上有残留,会产生染色不均匀、阳性物时隐时现、真假难辨、背景染色增加等后果。
目前用于脱蜡的试剂效果最好的是二甲苯,脱蜡力强,且时间短,但由于其有一定危害性,近年来无毒环保脱腊液的使用也越来越多。
(2)脱蜡的时间要根据季节、室温和试剂的新鲜程度作出调整
夏季,室温较高, 3-5分钟;冬季,室温较低,10-20分钟或更长。
若脱蜡剂陈旧则需要适当延长脱蜡时间。
(3)切片带有温度进行脱蜡,可加速脱蜡过程
如果预先切烤好的切片,在染色前对切片进行加温10-20分钟,再行脱蜡,这样脱蜡速度加快,效果更好。

5. PBS的清洗方式、次数和时间的选择?
(1)单独冲洗,防止交叉反应造成污染
(2)温柔冲洗,防止切片脱落
(3)有足够冲洗时间,才能彻底洗去结合物
(4)PBS的PH和离子强度有严格要求:中性及弱碱性条件(PH 7-8)有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则易于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成,高离子强度则易分解。
免疫组化目前常用PBS PH在7.2-7.4,浓度0.01M。

6. 一般在什么情况下进行组织抗原修复?
由于组织中部分抗原在甲醛或多聚甲醛固定过程中,发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用,从而失去抗原性。通过抗原修复,使得细胞内抗原决定簇重新暴露,提高抗原检测率。
修复方法从强到弱分为三种:高压修复、微波修复、胰酶修复。

未完待续。。。

作者: 义翘神州

北京义翘神州科技股份有限公司是一家从事生物试剂研发、生产、销售并提供技术服务的生物科技公司,主要业务包括重组蛋白、抗体、基因和培养基等产品,以及重组蛋白、抗体的开发和生物分析检测等服务,为全球的药品研发企业和生命科学研究机构提供高质量的生物试剂产品和高水平的技术服务。义翘神州的产品能够覆盖生命科学研究的多个领域,为分子生物学、细胞生物学、免疫学、发育生物学、干细胞研究等基础科研方向和创新药物研发提供“一站式”生物试剂产品和技术服务。



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