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技能篇 | IHC之路漫漫(下篇)

在上期:IHC之路漫漫(上篇)中,我们的实验达人对在IHC实验中,实验结果如何分析、Triton X-100的使用、如何才能充分脱蜡、一般在什么情况下进行组织抗原修复等问题进行经验总结,接下来我们将继续一抗的选择、如何减少非特异性染色等问题进行学习。

7. 封闭血清该如何选择?

实验中使用封闭血清,以消除非特异性染色,提高目的蛋白的准确性,同时降低背景。

封闭血清一般是和二抗同一来源的,由于二抗大多数是山羊二抗,因此常用山羊血清。有时也会用小牛血清、BSA、羊血清等,但不能与一抗的来源相同。

8. 一抗选择要点

一抗的选择是IHC实验能否成功的关键:

(1)单克隆或多克隆抗体的选择,各有优缺,根据实验目的决定。

一般单克隆抗体特异性强,但亲和力相对小,检测抗原灵敏度相对就低;而多克隆抗体特异性稍弱,但抗体的亲和力强,灵敏度高。

(2)确定一抗的应用范围

根据自己切片状况(石蜡或冰冻),选择适用IHC的抗体。

(3)一抗的种属来源决定选择相应的二抗

有的抗体可能存在种属差异。

(4)生产厂家的选择

尽量选择可以提供技术支持的制造商,这样可以详细的了解一抗的种属、来源、抗原、质检等信息。

9. 一抗在4℃孵育后为什么要进行37℃复温?

(1)防止脱片

切片如果从4℃取出后直接放入PBS缓冲液中,易发生脱片。

(2)使抗原抗体结合更稳定

对于一些表达较弱的抗原来说,这一步是必需的,在4℃时,抗原抗体分子碰撞几率和运动速率较低,在37℃时,抗原抗体结合更快。但同时也会提高敏感性,造成非特异性染色。

10. 脱片产生的原因以及如何防止脱片?

(1)黏附载玻片质量的问题

(2)组织切的不好,或切片机的问题——如比较钝的刀片切的厚或不均匀、切片者手法不好等

(3)组织问题,比如癌症组织有坏死等

(4)没烤好,时间短或温度不够

(5)操作时甩的太剧烈,有脱片嫌疑的片子最好不甩或轻甩,可用纸从边缘吸水

(6)修复问题:抗原修复时高压时间过长,或者放进修复液时直接丢入等。此外,用EDTA修复比柠檬酸更易脱片。

(7)当见到有组织漂起来时操作更要谨慎,用PBS时尽量用泡的。

11. DAB显色时间如何把握?

(1)DAB显色时间不固定的,主要在显微镜下控制显色时间,到出现阳性部分深棕色,无背景时即可冲洗;

(2)若DAB显色时间很短(如几秒或几十秒)就出现很深的棕褐色,可能意味着你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长,需要下调抗体浓度或缩短抗体孵育时间;

(3)若短时间就出现很深背景,可能是前面封闭非特异性蛋白不完全,需要延长封闭时间;

(4)DAB显色时间很长(如超过十几分钟)才出现阳性染色,一方面可能说明抗体浓度过低或孵育时间过短(最好一抗4度过夜);另一方面就是封闭时间过长。

12. 造成切片染色深的因素有哪些?如何才能减少非特异性染色?

(1)抗体浓度过——一抗浓度过高是常见的原因之一

解决措施:每次使用新抗体前应当对其工作浓度进行测试,使每一抗体个体化,找到适合自己实验室的理想工作浓度,既使是即用型的抗体也应如此,不能只简单的按说明书进行染色。

(2)抗体孵育时间过长或温度较高

解决措施:严格执行操作规程,避免因遗忘而造成时间延长。现在流行的二步法(Polymer)敏感性很高,要求一抗孵育的时间不是传统的1H,而是30min,因此,要根据染色结果进行调整。

(3)DAB变质和显色时间太长

解决措施:DAB最好现用现配,如有沉渣,过滤后再用。

配制好的DAB不能长时间存放,因为在没有酶的情况下,过氧化氢也会游离出氧原子与DAB产生反应而降低其效力,因此未用完的DAB存放在冰箱几天后再用也是不可取的。DAB的显色最好在显微镜下监控,达到理想染色程度时立即终止反应。

(4)组织变干——修复液溢出后未及时补充液体、染色切片太多、动作太慢、忘记滴液、滴液流失等原因造成。

解决措施:操作时要认真仔细,采用DAKO笔或PAP Pen在组织周围画圈,可以有效的避免液体流失,也能提高操作速度。

(5)一抗变质、质量差的多克隆抗体

解决措施:注意抗体有效期,过期抗体会出现不显色或背景着色。

好的实验结果,是发一篇好Paper的重要前提。希望以上经验分享能让大家获得一个好的前提。

篇幅有限,IHC实验过程中肯定还有更多的问题,欢迎大家在文章底部留下你在实验中遇到的难题,我们会邀请有着多年IHC实验经验的大佬们来为大家解答。

作者: 义翘神州

北京义翘神州科技股份有限公司是一家从事生物试剂研发、生产、销售并提供技术服务的生物科技公司,主要业务包括重组蛋白、抗体、基因和培养基等产品,以及重组蛋白、抗体的开发和生物分析检测等服务,为全球的药品研发企业和生命科学研究机构提供高质量的生物试剂产品和高水平的技术服务。义翘神州的产品能够覆盖生命科学研究的多个领域,为分子生物学、细胞生物学、免疫学、发育生物学、干细胞研究等基础科研方向和创新药物研发提供“一站式”生物试剂产品和技术服务。



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