小知识： 从荧光蛋白到有色蛋白

小编：五彩缤纷的自然界，是各种化合物在光的照射下，吸收、反射出特定波长的电磁波，使得我们看到了颜色。而自然界中有一类特殊蛋白质，竟然也可以拥有各种颜色（普通的蛋白质在可溶状态下一般是无色透明的，而其变性后沉淀是白色的），荧光蛋白（fluorescent proteins）和有色蛋白（chromoproteins），它们如此迷人。目前，荧光蛋白已经广泛用于生物学研究中，相信将来，会有更广泛的应用。

荧光蛋白

绿色荧光蛋白的发现

1955年，达文波特和尼科尔（Davenport和Nicol）首先注意到维多利亚水母（Aequorea victoria，水母刺猬属，水生动物门）的生物发光器官中存在荧光成分，但不知是什么物质。普林斯顿大学的下村修（Osamu Shimomura）第一个意识到这个荧光的产生实际上是一种蛋白质。在他的论文中描述了从水母中分离生物荧光蛋白，下村修写道，“一种蛋白质，在阳光下看起来略带绿色，在紫外灯下中呈现出非常明亮的绿色荧光”。

1971年，Morin和Hastings描述了从薮枝螅（Obelia）和类腔肠动物海肾（Renilla reniformis）分离了非常相似的绿色荧光蛋白。直到1979年下村修确定了荧光基团在多肽链内共价连接的4-（对羟基亚苄基）-5-咪唑烷酮，但发色团本身的性质仍然是个谜。实现这一突破不仅需要100 吨来自水母的天然绿色荧光蛋白的辛苦，而且下村修也有高超的化学直觉。

初步克隆和重组表达

直到1992年，分子生物技术取得了迅速发展，Prasher对绿色荧光蛋白的cDNA进行克隆， 238个氨基酸的完整一级序列才最终被揭示。仅仅两年之后，Chalfie报道编码的绿色荧光蛋白的基因可以在线虫Caenorhabditis elegans的感觉神经元中功能性表达，Inouye和Tsuji表明该基因可在大肠杆菌中的表达， 形成绿色荧光细菌。

生物研究界在过去二十年中开发了许多强大的分子生物学技术，很快就认识到遗传编码荧光蛋白作为基因表达和蛋白质定位标记的独特效用。因此，到1995年11月，至少还有36个重组的应用实例用到了绿色荧光蛋白，并在数十年中，应用的文章呈高速增长的态势。现在看来，基因的克隆和非水母生物中重组表达标志着荧光蛋白研究历史上一个重要的转折点。

绿色荧光蛋白结构

GFP具有β桶结构，由11条具有褶皱片排列的β-链组成，包含穿过中心的共价键合的发色团 4-（对羟基亚苄基）咪唑烷-5-酮（HBI）。HBI是三肽Ser65-Tyr66-Gly67的自发修饰形式，在没有正确折叠的GFP支架的情况下是非荧光的，并且主要以GFP中的非离子化酚形式存在。桶的向内侧链在Ser65-Tyr66-Gly67中诱导特异性环化反应，其诱导HBI电离成酚盐形式和生色团形成。这种翻译后修饰过程称为成熟。氢键网络和与这些侧链的电子堆叠相互作用影响GFP及其众多衍生物的颜色。桶的紧密堆积性质排除了溶剂分子，保护发色团荧光免受水淬灭。除了Ser65-Tyr66-Gly67的自动环化之外，在Tyr66残基处发生1,2-脱氢反应。除了形成发色团的三个残基外，诸如Gln94，Arg96，His148，Thr203和Glu222的残基都充当稳定剂。Gln94，Arg96和His148的残基能够通过使发色团电荷离域而稳定。Arg96是最重要的稳定残留物，因为它促使HBI环发生必要的结构重新调整。Arg96残基的任何突变都会导致发色团的生成速率降低，因为会失去适当的静电和空间相互作用。Tyr66是氢键的接受者，并且不会电离以产生有利的静电。

新荧光蛋白的发现

珊瑚来源荧光蛋白：绿色荧光蛋白的日益普及，以及对除绿色以外的波长发出荧光的其他变体的需求，促使研究人员开始寻找其他海洋生物中的同源蛋白。1999年底，当时来自俄罗斯科学院的研究人员报告说，珊瑚礁珊瑚虫含有荧光蛋白，色调从青色到红色。

非刺胞动物中的荧光蛋白：近年来，已在几种非刺胞动物中鉴定出荧光蛋白。具体而言，已经在3种文昌鱼（Chordata，subphylum Cephalochordata）和桡足动物甲壳类动物（节肢动物门，甲壳动物门）中鉴定出荧光蛋白。

FMN结合荧光蛋白（FbFPs）：2007年开发，是一类小的（11-16 kDa）氧不依赖荧光蛋白，来源于蓝光受体。它们特别适用于在厌氧或低氧条件下使用，因为黄素发色团的形成和结合不需要分子氧。

小型超红色荧光蛋白（smURFP）：由蓝藻（Trichodesmium erythraeum）藻胆蛋白，α- 别藻蓝蛋白进化而来。smURFP 自动催化自发结合发色团胆绿素。smURFP不需要氧气，且具有较大的消光系数（180,000 M -1 cm -1），具有适度的量子产率（0.20），这使其与eGFP的生物物理亮度相当，比从大多数红色或远红色荧光蛋白得到的亮度高2倍。

新荧光蛋白的创造

由于广泛使用的潜力和研究人员不断变化的需求，目前已经设计了许多不同的GFP突变体。第一个主要改进是1995年由钱永健在Nature报道的单点突变（S65T）。该突变显着改善了GFP的光谱特征，导致荧光增强，光稳定性和主要激发峰向488nm的移动，峰值发射保持在509nm。这与通常可用的FITC的光谱特征相匹配过滤器组，增加了一般研究人员的实用性。2006年报道了超级折叠GFP，这是一系列允许GFP快速折叠和成熟的突变。

各种颜色突变体，包括是蓝色荧光蛋白（EBFP，EBFP2，Azurite，mKalama1），青色荧光蛋白（ECFP，Cerulean，CyPet，mTurquoise2）和黄色荧光蛋白衍生物（YFP，YPet）。BFP衍生物（mKalama1除外）含有Y66H取代。它们在接近380纳米的紫外线中显示出宽的吸收带，在448纳米处具有最大发射。也开发出优先结合Zn（II）和Cu（II）的绿色荧光蛋白突变体（BFPms1）。BFPms1有几个重要的突变，包括和BFP发色团（Y66H），Y145F用于更高的量子产率，H148G用于在β桶中形成空穴以及其他一些增加溶解度的突变。Zn（II）结合增加荧光强度，而Cu（II）结合淬灭荧光并将吸光度最大值从379nm移至444nm。因此，它们可以用作Zn生物传感器。

2008年诺贝尔化学奖

2008年10月8日，诺贝尔化学奖授予了日本学者下村修、美国科学家马丁-查尔菲（Martin Chalfie），以及美国华裔科学家钱永健。他们三人在发现和研究绿色荧光蛋白(GFP)方面有突出成就。下村修首次从维多利亚水母Aequorea victoria中分离出GFP，并发现该蛋白在紫外线下会发出明亮的绿光。 马丁-查尔菲证明了GFP作为多种生物学现象的发光遗传标记的价值。在最初的一项实验中，他用GFP使秀丽隐杆线虫的6个单独细胞有了颜色。钱永健的主要贡献在于让人们理解了GFP发出荧光的机制。同时，他拓展出绿色之外的可用于标记的其他颜色，从而使科学家能够对各种蛋白和细胞施以不同的色彩。这一切，令在同一时间跟踪多个不同的生物学过程成为现实。

荧光蛋白的应用

荧光蛋白已成为众多技术的核心，从单分子标记研究到标记整个生物体，包括活细胞和固定细胞的成像。

蛋白质定位标记

标记感兴趣的蛋白质并准确确定其定位，以及实时观察其表达模式、丰度、与其他分子的相互作用、周转、活动和运输等。

蛋白质 – 蛋白质相互作通过直接观察，可以通过鉴定和确认其元素之间的稳定或动态相互作用，更深入地了解分子复合物在活细胞中的功能。用于研究这些相互作用的技术是两个FP分子之间的F?rster共振能量转移（FRET），荧光相关光谱（FCS）检测分子的平均浓度和扩散速率，以及双分子荧光互补（BiFC）分析使用FP分成两个不重叠的N-和C-末端片段。

细胞器标签

将FP靶向特定细胞器允许可视化和研究局部细胞生理学、结构和动力学。靶向序列用于将FP定位于特定的细胞器和细胞区室，包括但不限于细胞核、质膜、过氧化物酶体、细胞质、线粒体和高尔基。

细胞和组织标记

在特定细胞类型中表达FP有助于研究细胞周期进展、细胞形态、细胞运动性、细胞培养物、组织或整个动物内的相互作用。

基因表达

mRNA和转录因子的可视化允许定量研究它们在细胞中的产生、定位、寿命和动态变化。 FP在特定启动子控制下的表达在所需条件（活化或失活），空间和时间或响应应激因子下显示启动子活性。这些测量对于研究基因调控网络的机制至关重要。

计时器

使用随时间改变其光谱特性的特殊类FP（定时器FP）可以访问动态过程的时间和空间分量。一些例子包括细胞，细胞器和分子的年龄，基因表达的动力学和启动子激活的时间。这些计时器可以设计用于测量从大约10分钟到许多小时的时间跨度。

扩散和流动性

光漂白后的荧光恢复（FRAP）和FCS等光漂白技术可以对活细胞中的分子扩散或迁移进行详细研究，以及这些过程如何受到外部因素的影响。

传感器

已经开发了一类专门的FPs，其中FP与检测器蛋白质组合以测量特定分子种类的浓度变化。这些传感器可用于研究pH，Ca2+，H2O2，氧化还原电位和膜电位的变化。

有色蛋白

珊瑚礁因为存在荧光蛋白（FPs）和有色蛋白（CPs）而有丰富的颜色，这些蛋白质与水母绿色荧光蛋白（GFP）构成同源真核蛋白家族。这些GFP同源物是由单个基因编码的小蛋白质，在表达的组织中包含相对高百分比的可溶性蛋白质，并且它们发色团的形成不需要辅助因子或除氧之外的底物。这些特性促进工程改造体内的成像研究。与FP相比，CP吸收可见光，使环境光下的颜色清晰可见，几乎所有这些蛋白都具有低荧光。

CP吸收特性赋予CP具有优于FP的某些优点，例如FP的检测需要紫外线（UV）灯，荧光计或流式细胞仪，并且可能受到样品的背景荧光，光漂白和UV损伤的限制，而CP只需要通过眼睛即可观察。因此，CP作为生物体中的标记物特别具有吸引力，用于年度国际基因工程机械（iGEM），作为染料替代品、用于艺术，以及用于成本和低资源的领域中的细胞生物传感器应用是重要的考虑因素。目前用于检测环境，农业和食品污染物，地雷和生物战剂以及医学相关目标的方法可以通过合成生物学来改进。例如，噬菌体已经被设计成引起食物中病原菌的生物发光，并且在检测到变质的肉类气体，三硝基甲苯（TNT）产物或砷时，细菌被设计成发荧光。这些生物传感器适用于非荧光检测，适用于超市或现场使用。

LB氯霉素琼脂平板在37 °C培养20小时比较（左，顺时针从12点开始）meffBlue，aeBlue，cjBlue，amilGFP，fwYellow，amajLime，scOrange，amilCP和（右，顺时针从顶部开始）gfasPurple ，eforRed，asPink（asCP），meffRed，tsPurple和spisPink由高拷贝质粒表达。 b cjBlue和meffRed与全色显色后相似的有色CP的比较= 37°C，持续4天（顺时针从12点开始：控制无启动子的aeBlue，也缺少核糖体结合位点，scOrange，meffRed，eforRed， spisPink，meffBlue，cjBlue和aeBlue）。

amilCP蛋白的氨基酸位置C64和Q65进行随机诱变，选择不同颜色的细菌菌落在LB平板上划线。