您的位置 首页 DNA/RNA技术

提纯你的DNA样本,很急、很关键!

在分子生物学实验中,提纯DNA样本是十分常见的步骤。纯净无杂质的DNA有助于下一步或几步实验的发生和成功。有时候DNA是直接从细胞提取出来的、有的时候要用到从PCR反应中来的DNA、或是在酶切反应后来的DNA;那么就有可能携带细胞裂解时的碎片、残留的蛋白质、或是残留的盐溶液。这些物质有可能影响到下一步的反应,所以需要被清除掉以获得纯净的DNA。小编在这里介绍四种提纯DNA的方法供大家讨论。

苯酚-氯仿抽提法

苯酚和氯仿是常见的有机溶剂,一般可以用来将蛋白杂质从DNA样本里去除。基本原理是,有机溶剂会使杂质蛋白变性,并将杂质蛋白留在有机溶剂层,而DNA分子是有水溶性的,所以会进入水溶液层【1】。这样DNA和杂质蛋白就被分开了。这个方法的好处是便宜有效,特别是在提取基因组DNA时,要去掉许多从细胞裂解液中带来的蛋白,苯酚法十分好用但苯酚和氯仿是有毒溶剂,而且有可能会残留在提纯过后的DNA样本中,对后续反应造成影响。

苯酚抽提的基本步骤

  • 将同体积的苯酚和(DNA+蛋白)混合物溶液混合;
  • 苯酚和水溶液不互溶,所以分层,水层在上,苯酚层在下。快速震荡,让两层充分混合;
  • 静置让两液层分开,分离水层,在水层中得到的应该是大量的DNA和可能少量的蛋白质。

苯酚抽提基本原理

最核心的原理是水和苯酚作为有极性差异的溶剂,对DNA和蛋白质有不同的溶解能力。因为水分子中的氧原子有更强的电负性,共用电子对向氧原子偏离,产生了看似略带负电的氧原子端和略带正电的氢原子端,所以我们说水是很有极性的溶剂(如下图)。苯酚也有极性,但不像水分子那么明显,因为苯环也有电负性,所以苯酚的氧原子并不能太强吸引周围的电子(如下图)。

1

有一点我们是清楚的,DNA可溶于水,原因就是DNA也是有极性的分子(如下图,DNA分子的糖磷骨架上的磷酸基团是带负电的)。对于一物质是否水溶,我们基本可以总结出:有极性(polar=亲水性(hydrophilic=可溶;无极性(non-polar=憎水性(hydrophobic=不溶。

2

还有一点我们也是清楚的,细胞液环境是水环境,里面到溶解着各种蛋白质。蛋白质作为长链氨基酸,在形成有效结构的时候,外表面多是有极性的亲水类氨基酸(如谷氨酸、Glu;赖氨酸、Lys和组氨酸、His),内核多是没那么有极性的憎水类氨基酸,所以能够稳定的存在于水溶液中。

但是,在苯酚抽提法中,蛋白质在水中的溶解度被改变了。水溶液作为极性溶剂,导致了蛋白质的极性氨基酸在外,而没那没有极性的氨基酸在内;苯酚的到来,使得这些没那么有极性的氨基酸有了出头之日,他们被翻了出来,而那些有极性的氨基酸则被塞进蛋白质内核,以适应苯酚溶剂(基本原理如下图所示)。这样一来,变性的蛋白进入苯酚层,DNA则停留在水层。这也是为什么,有机溶剂会让蛋白质变性,因为不可逆地破坏了蛋白的整体结构。

3

苯酚抽提的过程和蛋白质变性原理

乙醇沉降法

乙醇沉降法其实就是一种盐析方法。盐阳离子(一般是Na+、醋酸钠盐)和70%的乙醇加入到DNA样本中后,阳离子与带负电的DNA骨架相互作用,从水分子那里将DNA抢夺出来,而乙醇改变了DNA的结构,使得DNA聚合最终沉降【2】。这个方法的好处也是便宜有效,但十分费时,而且乙醇也有可能被带入下一步反应中。

乙醇沉降法基本步骤

将盐溶液和乙醇与DNA溶液混合后,DNA会被析出形成固体,经过一定时间的离心沉淀,DNA就可以从混合溶液中分离出来。最后使用冷的70%乙醇冲洗DNA沉淀,最终获得纯净的DNA沉淀。DNA沉淀在静置晾干后可以直接溶于水溶液(如下图)。

4

乙醇沉降法基本原理

首先,我们要了解的是DNA分子为什么可以溶于水。作为极性分子,水分子可以被看成氧原子带部分负电,氢原子带部分正电,因此可以很好的稳定住带负电的磷酸基团。

那么,当我们向DNA水溶液中加入盐溶液(一般常用乙酸钠)时,带正电的 Na+ 会和水分子竞争去接触负电磷酸基团的机会,一旦Na+ 抢夺到了DNA分子的磷酸基团,DNA分子就不那么受水分子喜欢,所以就变得有憎水性,可以从水分子中析出。

既然 Na+ 和DNA分子接触后可以看成是有了憎水性,而我们想让这个憎水性更强,乙醇就在这时发挥作用。 Na+ 和PO3- 两基团是在动态碰撞中相互接触,并不会像共价键似得结合在一起,所以Na+ 和PO3- 之间的接触机会是由阻挡在他们之间的溶剂决定的,电容率高的水分子比电容率低的乙醇分子更容易也更喜欢阻挡Na+ 去寻找PO3- 。所以试想一下,如果我们是Na+ 和PO3-,肯定更喜欢待在乙醇环境中。因此环境改变,使得DNA分子的憎水性更强。

最后一步就是使用冷乙醇冲洗掉任何残留的盐,保证DNA的纯净度。当然,在了解过大致原理以后,我们还是有很多事项要注意,比如盐的使用、乙醇好还是异丙醇好、用多大量的乙醇等。

硅胶柱吸附法

最常见的就是市面上各种PCR purification kit、mini-prep kit和gel extraction kit。只有被离液盐扰乱了氢键的DNA分子可以被吸附在硅胶模上,最后可以被低盐溶液析出。这个方法的优势就是快速高效,可以一次处理大量不同的DNA样本。不足之处就是成本略高。

基本原理如下图所示。在高盐环境中,盐阳离子打破硅胶负氧根和水之间的氢键,使得整体的硅胶携带正电,正好吸引携带负电的DNA分子。当DNA分子附着在硅胶上时,洗涤液可以将不能与硅胶结合的杂物分子洗掉。然后,使用低离子强度的缓冲液或者水,可以将DNA洗脱出去。加热过的洗脱液(<50°C)可以加速DNA从硅胶膜上脱离下来。不同的硅胶由于制作方法不同,会拥有不同的膜孔大小,所以可以拦截吸附不同长度的DNA分子。

1

 

磁珠吸附法

这个方法的主要原理是,在携带正电的磁珠和DNA分子特定结合后,磁珠被固定在磁极上,DNA样本中的其他杂质在此时被移除,而后使用高pH的洗出液使得磁珠带负电,因此DNA分子又会脱离磁珠,被洗出。Thermo Fisher公司出的ChargeSwitch 就是用磁珠吸附法来提纯DNA的。

Reference:

【1】Kirby, K. S. (1957). A new method for the isolation of deoxyribonucleic acids: evidence on the nature of bonds between deoxyribonucleic acid and protein. Biochemical Journal, 66(3), 495.

【2】Eickbush, T. H., & Moudrianakis, E. N. (1978). The compaction of DNA helices into either continuous supercoils or folded-fiber rods and toroids.Cell, 13(2), 295-306.

图片来自网络,内容由BioEngX原创,转载请注明!


扫描下方二维码关注BioEngX官方微信公众平台
qrcode_for_gh_1d4074a25cf9_258

作者: 卢阳

伦敦大学学院博士,研究方向为生物催化和细胞色素P450开发;BioEngX创始人之一。知乎主页:簏岩。



发表回复

您的电子邮箱地址不会被公开。

评论列表(1)

  1. 敬爱的作者,您好,学生对您的文章中苯酚-氯仿抽提法部分存在疑问。
    学生认为苯酚中苯环和氧之间共轭形成大π键使氧氢键(共用电子对)向氧偏移,所以与水比较而言苯酚氧氢键弱,易电离,酸性更强。也就是说就极性而言,苯酚的极性要大于水的极性,这与您的观点不符,那到底如何解释苯酚抽提法的原理,还有氯仿在其中的作用又是什么,是否一定需要氯仿呢。
    很冒昧对您的观点提出质疑,非常希望能得到您的解答!

联系我们

联系我们

(44)07934433023

在线咨询: QQ交谈

邮箱: info@bioengx.org

关注微信
微信扫一扫关注我们

微信扫一扫关注我们

关注微博
返回顶部
Designed by

best down free | web phu nu so | toc dep 2017