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GST融合蛋白纯化常见问题

问题一:目的蛋白结合效率低或不结合

可能原因:蛋白序列出现移码等错误

解决办法:测序确认,调整阅读框以获得GST.Tag融合表达蛋白;选择适宜的宿主菌,如蛋白酶缺陷型大肠杆菌,稀有密码子宿主菌Rosetta系列。

可能原因:GST 融合蛋白被机械裂解的方法变性(比如超声)

解决办法:过度超声产热会破坏标签蛋白,建议采用超高压破碎。

可能原因:GST 融合蛋白发生聚集沉淀

解决办法:在裂解buffer和其他缓冲体系中加入DTT,经验告知,1-20mM的DTT 会显著增加某些GST融合蛋白的结合。

可能原因:GST融合蛋白被过度稀释

解决办法:重新浓缩样品,增加蛋白浓度。

可能原因:融合蛋白可能改变了GST 的构象,因此降低了GST 标签蛋白的结合能力。

解决办法:检测所使用的pGEX 载体中GST的结合。准备带有所使用的pGEX的细胞超声裂解物,检测其与层析柱的结合。如果结合的很好,则可能是标签蛋白改变了GST 的构象,因此降低了GST 标签蛋白的亲和力。可以通过降低结合的温度到4°C限制洗涤来改善结果。

可能原因:结合缓冲条件不适宜

解决办法:低于pH6.5或高于pH8时,融合蛋白与层析柱结合不充分导致结合效率低,请确认磁珠在用于目的蛋白纯化前经过pH6.5~8.0缓冲液充分的平衡。

可能原因:层析柱使用次数过多,杂质干扰

解决办法:层析柱再生或使用新的层析柱。

问题二:目的蛋白洗脱不下来或洗脱率低

可能原因:洗脱缓冲液的体积太少

解决办法:增加洗脱缓冲液的体积。

可能原因:洗脱的时间不够

解决办法:增加洗脱缓冲液与磁珠反应的时间。

可能原因:洗脱缓冲液中谷胱甘肽浓度太低

解决办法:增加洗脱缓冲液中谷胱甘肽的浓度

可能原因:洗脱缓冲液的pH过低

解决办法:调节洗脱缓冲液pH值至8-9 。

可能原因:洗脱缓冲液的离子强度过低

解决办法:增加洗脱缓冲液中的离子强度,在洗脱缓冲液中加入0.1~0.2M的氯化钠也会改善洗脱效果。

可能原因:洗脱缓冲液中谷胱甘肽失效被氧化

解决办法:洗脱缓冲液现配现用。

问题三:洗脱的蛋白中有杂质

可能原因:GST融合蛋白被蛋白酶部分降解

解决办法:加入蛋白酶抑制剂PMSF。注:丝氨酸蛋白酶抑制剂必须在使用凝血酶或凝血因子Xa 前除去。

可能原因:在宿主细菌中蛋白被降解

解决办法:使用蛋白酶缺陷型菌株lon-或ompT,或ompT和lon双缺陷型菌株。

可能原因:细胞破碎时超声处理过度

解决办法:降低裂解时间,机械裂解前加入溶菌酶(0.1 倍体积的10 毫克/毫升溶菌酶溶液,溶菌酶保存在25mM Tris-HCl,pH8.0 )可能会使结果变好。避免发泡,因为这可能使标签蛋白变性。过分裂解也会导致宿主细胞蛋白和GST 标签蛋白共纯化。

可能原因:分子伴侣可能被共纯化了

解决办法:多余的条带可能由于共纯化一些分子伴侣所造成。这些分子伴侣参与大肠杆菌中新生成的蛋白的正确折叠。如:DnaK(分子量70 000)、DnaJ(分子量37 000)、GrpE(分子量40 000)GroEL (分子量57 000)、GroES(分子量10 000 )。一些从这些共纯化的蛋白中分离GST融合蛋白的方法已经发表。

问题四:目的蛋白酶切后电泳检测发现多条条带

可能原因:蛋白酶切发生在宿主细菌内

解决办法:检测条带何时出现:如果确定多余的条带在Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa切割前不存在,这些条带可能是在宿主细菌中被降解的结果。目的蛋白可能含有Precission Protease,凝血酶,凝血因子Xa 的切割位点,请检查序列。

作者: KMDBIOSCIENCE

卡梅德生物科技(天津)有限公司位于天津市的西北部-武清区,研发中心位于湖北省武汉市洪山区,是集研发、生产、销售为一体的综合性创新技术应用企业。公司旨在为客户提供高质量的实验外包服务(CRO服务),包括实验方案设计,常规基因工程实验操作,重组蛋白表达与纯化,重组抗体制备,天然蛋白分离与纯化,病毒分离培养等免疫学相关技术服务;同时我们也为工业客户提供部分IVD级别抗体和抗原原料。



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