您的位置 首页 DNA/RNA技术

干货 | 实验篇之RT-PCR

发布: 2018-12-22 138阅读 101评论

作者：高天政

逆转录实验作为是常见的分子生物学实验之一，虽然看上去步骤简单，但当你实际操作时就会发现各种问题扑面而来，相信各位小伙伴都有被一个简单的逆转录实验搞得头晕眼花的时候，今天就由小编给大家介绍一下逆转录实验中的注意事项和常见问题，希望大家学以致用哦！

图1. 逆转录过程

逆转录（reverse transcription）是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，即 RNA 指导下的 DNA 合成，逆转录实验包括3大要素，分别是引物、逆转录酶和 RNA 模板：

1. 引物：逆转录引物主要有3种，包括 Oligo（dT）、Random Primers 和基因特异性引物（GSP）。其中 Oligo（dT）具有12-20个 T 碱基，并且与真核生物 mRNA 的 3’Poly A 尾配对，可合成全长的 cDNA，但仅扩增有 polyA 尾的 mRNA ，对模板质量要求高，较适合克隆实验。而 Random Primers 具有6-9个碱基，可随机识别模板并结合，适合复杂结构和微量模板，但特异性低，小片段多，适合后续 qPCR 实验。基因特异性引物可以识别特定模板序列，具有特异性强，灵敏度高的特点，但需合成特定的序列。所以根据不同实验需求可进行相应引物的选择。

2. 逆转录酶：一种是来自纯化的禽成髓细胞瘤病毒（AMV），由两条肽链组成，具有聚合酶活性和很强的 RNaseH 活性，它最适温度是42℃，最适 pH8.3，在高反应温度时可消除 mRNA 的二级结构对逆转录的阻碍，然而高水平的 RNaseH 的活性既抑制 cDNA 产生也限制其长度。另一种来源于鼠白血病病毒（M-MLV），是单肽链的，有 RNA 聚合酶活性和相对较弱的 RNaseH 活性，最适温度37℃，最适 pH7.6，较弱的 RNaseH 活性对获得2-3kb的 mRNA 的全长 cDNA 有很大好处。

3. RNA 模板：通常利用紫外分光光度计检测纯度，要求A260/280=1.9~2.1，A260/230=2.0~2.2。利用琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 的完整度，完整的总 RNA 在进行琼脂糖凝胶电泳时会产生清晰的28S 和18S rRNA 条带（真核样品），28S rRNA 条带的强度应当大致为18S rRNA 条带的两倍，并且无 gDNA 和蛋白残留。

图2. 琼脂糖凝胶电泳检测 RNA 完整性

上面给大家简单介绍了一下逆转录的3大要素，除此之外在实际的操作过程中，还会有各种各样的让问题我们措手不及，下面给大家一一详细解答！

1. 如何提高 RT-PCR 反应的灵敏度与特异性？

① 确定模板 RNA 完整性好，无 DNA 污染。
② RNA 模板中不应含有扩增反应抑制剂。
③ 使用适量的模板 RNA ，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
④ 若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。

2. RNA 中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？

逆转录抑制剂包括：SDS 、EDTA 、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐等等。可将已确定的高质量 RNA 模板同样品混合，同高质量 RNA 模板比较产量以检测 RNA 抑制剂；若高质量模板 RNA 与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对 RNA 沉淀进行清洗，以除去抑制剂。

3. 逆转录后的 qPCR 实验 Ct 值偏大或者普通 PCR 产量低。

① RNA 模板质量差，需要重新制备 RNA 模板，可通过琼脂糖凝胶电泳检测质量。
② 逆转录后的 cDNA 中含有高浓度的模板 RNA 和逆转录试剂成分，可能会对后续的PCR 产生抑制作用，所以可以适当梯度提高 cDNA 稀释比例（通常来说可将 cDNA 原液稀释5-10倍，其最佳模板加入量以扩增得到的 Ct 值在20-30个循环为好）。
③ 起始的 RNA 模板量低，需要减少稀释倍数或增加 RNA 模板量。
④ 基因本身原因（复杂和长度），可以重新设计复杂基因的引物，避免复杂结构。或者用三步法程序或延长两步法程序的延伸时间。
⑤ 逆转录或者定量产品性能差，可以通过做平行不用品牌产品对比实验，对比逆转录产品性能。

4. 逆转录酶扩增效率评估，应该关注哪些指标？

建议： qPCR-ct 值，或者 PCR 产量
如果想比较逆转录性能，最为直接的还是后续做 qPCR 或者 PCR 平行对比实验，这种方法相对较为准确。
不建议：cDNA 中间产物浓度测定 or 其他方法。
逆转录完成后是不建议测定产物浓度的，由于逆转录后产生 RNA-cDNA 杂交链，溶液中的 RNA 和部分 DNA 会对吸光值产生影响，所以测定出来的产物浓度并不准确，即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的试剂盒进行对比实验，由于不同品牌之间的逆转录体系具有或多或少的差异，其体系中的各种离子等都能对吸光度产生影响，所以测定的结果也没有可比性。

优化及注意事项
① 逆转录 PCR 时，提取 RNA 是关键，需分离高质量 RNA（纯度和完整性）。
② 整个操作过程需使用去 RNA 酶的枪头、EP 管等耗材。
③ 逆转录过程中要谨防 RNA 酶的污染，加入 RNA 酶抑制剂。
④ 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
⑤ 逆转录实验应全程在冰上操作完成，操作过程应避免 RNase 污染。
⑥ 提高逆转录预热温度（也可根据相应逆转录试剂盒进行调整）。
⑦ 减少基因组 DNA 污染，可使用去基因组的逆转录试剂盒。

Tip

诺禾致源新推出重磅逆转录试剂盒——Honor™ II 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR（gDNA digester plus），便捷、高效，详情戳右边?：小猪佩奇身上纹，逆转录 SuperMix 送给实验人

联系我们：

① 咨询当地客户经理；
② 发送邮件至 enzyme@novogene.com；
③ 拨打文章底部咨询热线，诺禾致源酶试剂业务线竭诚为您服务！

酶试剂研究部 高天政丨文案
孙津津丨编辑
配图来源于网络，侵删

1.15K赞
标签:



相关文章

发表回复

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注

评论列表(101)

  10. This website online is known as a stroll-through for all of the information you wanted about this and didn’t know who to ask. Glimpse here, and also you’ll undoubtedly uncover it.

    https://youtu.be/GgmHS5mFzdk

    回复

  14. I used to be more than happy to seek out this internet-site.I wanted to thanks for your time for this excellent read!! I undoubtedly enjoying each little little bit of it and I have you bookmarked to take a look at new stuff you weblog post.

    https://youtu.be/DH_2g3CEfLU

    回复

  16. I am only commenting to make you know of the superb discovery my wife’s girl experienced going through your webblog. She picked up too many things, which include what it’s like to possess an awesome teaching character to let the others without hassle know a variety of grueling subject areas. You undoubtedly surpassed visitors’ expectations. Thanks for offering such useful, healthy, explanatory and even easy guidance on that topic to Gloria.

    https://www.oraclemobilesecurity.com/

    回复

  25. magnificent post, very informative. I wonder why the other experts of this sector do not notice this. You must continue your writing. I am confident, you’ve a great readers’ base already!

    https://youtu.be/_befRHkRLqw

    回复

  40. You could definitely see your skills in the work you write. The world hopes for more passionate writers like you who aren’t afraid to say how they believe. Always follow your heart.

    https://youtu.be/wniyphcM4wE

    回复

  50. I’ve been surfing on-line greater than 3 hours lately, but I never discovered any fascinating article like yours. It¦s beautiful value sufficient for me. In my opinion, if all website owners and bloggers made just right content as you probably did, the web might be a lot more helpful than ever before.

    http://www.tlovertonet.com/

    回复

  77. Wow, incredible weblog format! How long have you been blogging for?
    you make running a blog look easy. The whole glance of
    your site is wonderful, as smartly as the content!
    You can see similar here sklep internetowy

    回复
联系我们

联系我们

(44)07934433023

在线咨询: QQ交谈

邮箱: info@bioengx.org

关注微信
微信扫一扫关注我们

微信扫一扫关注我们

关注微博
返回顶部