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DNA连接反应中不可忽略的技巧

在前面的文章中,小编给大家了讲了如何让酶切“时半功倍”的技巧。既然提到了酶切反应 (digestion reaction),那就少不了它在分子实验中的“亲密伙伴”-连接反应 (ligation reaction)。今天这篇文章,给大家介绍一些可以提高连接效率 (ligation efficiency),减少实验重复时间的操作技巧。在DNA 片段的连接反应中,最重要的角色就是DNA连接酶 (DNA ligase)。它可以催化两条DNA双链上相邻的5′磷酸基和3′羟基之间形成磷酸二酯键 (phosphodiester bonds)。连接酶的催化作用是需要消耗ATP(Adenosine triphosphate)的。无论是单股还是双股DNA,都可以通过这种方法粘合起来。不但如此,它还可以连接具有互补粘性末端(sticky ends)或是平末端(blunt ends)的DNA 片段(如下图),在分子生物学中应用非常广泛。但是不得不说的是,在进行插入连接时,要得到较高的转化效率是十分困难的。 那么今天小编就会给大家介绍一下连接反应实验操作过程中需要注意的几个方面,哪怕是小细节,也至关重要。
  1. DNA连接酶的最佳工作温度是25度左右,也就是室温。而把DNA两端连接在一起的最佳温度(optimal temperature)是1度左右。这样就出现了一个很大的温度差。到底选什么温度呢?根据个人经验,大家可以先在室温下孵育一个小时,然后把混合物放在4度冰箱里一晚上。这样效率大大提高了。当然,大家还要考虑连接反应中DNA片段是带有互补粘性末端的还是平末端的。
  2. 连接缓冲液(ligation buffer)里含有ATP,也是整个反应中必不可少的。但是ATP会随着时间的增长而降解,尤其是在反复冻融循环时(freeze-thaw cycle)。所以大家做这个实验的时候千万不要偷懒,一定要提前把连接缓冲液一次性融化之后分成小份储存(make aliquots)。在使用前,将一份分装的缓冲液放在室温融化或用手掌温度辅助融化,然后放在冰里。但是千万不要加热融化,否则ATP还是会降解,分装的精力也白费了。
  3. 不但要有对照(controls),而且还要尝试不同的 vector: insert 比例。因为每一个连接反应在分子水平发生时都是不完全一样的,照搬网上或是别人的实验方法肯定是行不通的。大家不妨在做连接反应的时候,尝试着使用下面表格中提到的条件,然后把含有质粒的连接反应物在大肠杆菌中进行转化(bacterial transformation),通过菌落的多少来检验连接效率。
Vector Insert Insert: Vector DNA Ligase 注释
实验1 1:1 这是常用的比例。大家需要自己通过实验来找到最优比例。
实验2 3:1
实验3 10:1
控制 1 对没有被酶切或是重新连接在一起的质粒进行定量。
控制2 对没有被酶切的质粒进行定量。

 

以上技巧是小编根据个人经验和网上资料整理得来的,如果有更好的建议和意见,也欢迎各位小伙伴留言告诉我们。

作者: 卢阳

伦敦大学学院博士,研究方向为生物催化和细胞色素P450开发;BioEngX创始人之一。知乎主页:簏岩。



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