Western blot 结果中背景较高 (high background):
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膜封闭不够/封闭液 (blocking buffer)不适合:延长封闭时间,增加封闭液的浓度;尝试不同种类的封闭液,对比结果后选出效果最佳的。
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洗膜不够彻底:增长洗涤时间;增加洗涤剂的浓度。
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一抗/二抗 (primary/secondary antibodies) 稀释度不适宜:对抗体进行滴度测试 (titre test),选择最适宜的抗体稀释度。
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一抗是多克隆抗体 (polyclonal antibody): 特异性降低,可能与其他蛋白结合,建议换用单克隆抗体 (monoclonal antibody)。
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膜在实验过程中干过: 实验过程中要切记保持膜的湿润。
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检测时曝光时间过长: 减少曝光时间。
结果中杂带较多 (multiple/non-specific bands):
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目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点 (phosphorylation site)、糖基化位点 (glycosylation site)、乙酰化位点 (acetylation site) 等),本身可以呈现多条带。
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样本处理过程中目的蛋白发生降解 (protein degradation): 加入蛋白酶抑制剂 (protease inhibitor);样本处理时在冰上操作; 避免/减少样本的冻融循环 (free-and-thaw cycle)。
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样本处理过程中目的蛋白发生聚集(protein aggregation):增加DTT的浓度;增长加热的时间。
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上样量(sample loading)/ 样本浓度过高:适当减少上样量/样本浓度。
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一抗是多克隆抗体 (polyclonal antibody): 特异性降低,可能与其他蛋白结合,建议换用单克隆抗体 (monoclonal antibody)。
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一抗/二抗不纯:纯化抗体;购买高纯度抗体。
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一抗或者二抗浓度偏高:降低抗体浓度,对抗体进行滴度测试 (titre test),选择最适宜的抗体稀释度。
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膜封闭不够/封闭液 (blocking buffer)不适合:延长封闭时间,增加封闭液的浓度;尝试不同种类的封闭液,对比结果后选出效果最佳的。
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洗膜不够彻底:增长洗涤时间;增加洗涤剂的浓度。
结果中无信号或显示信号弱:
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检测样本没有表达目的蛋白:选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性。
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检测样本低表达目的蛋白:提高上样量/样本浓度,裂解液 (lysis buffer)中记得加入蛋白酶抑制剂。
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转移不完全或过转移:可以用丽春红(Ponceau S)染膜并结合考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)染胶来确定条带是否成功转渍到膜上或是转移过度。根据结果可以适当调整转膜的时间和电流。
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抗体不能识别测试种属的相关蛋白:购买抗体前要认真阅读抗体说明书,确定是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
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一抗孵育时间不足:建议放在4℃过夜结合。
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二抗与一抗不匹配:检查并且选择正确的针对一抗来源的种属的抗体。
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洗膜过度:洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂 (detergent)不宜过强或过多,建议使用0.05-0.1%的弱去垢剂Tween-20。
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