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Western Blot 常见问题和处理方法

Western blot 结果中背景较高 (high background):

  • 膜封闭不够/封闭液 (blocking buffer)不适合:延长封闭时间,增加封闭液的浓度;尝试不同种类的封闭液,对比结果后选出效果最佳的。

  • 洗膜不够彻底:增长洗涤时间;增加洗涤剂的浓度。

  • 一抗/二抗 (primary/secondary antibodies) 稀释度不适宜:对抗体进行滴度测试 (titre test),选择最适宜的抗体稀释度。

  • 一抗是多克隆抗体 (polyclonal antibody): 特异性降低,可能与其他蛋白结合,建议换用单克隆抗体 (monoclonal antibody)。

  • 膜在实验过程中干过: 实验过程中要切记保持膜的湿润。

  • 检测时曝光时间过长: 减少曝光时间。

结果中杂带较多 (multiple/non-specific bands):

  • 目的蛋白有多个修饰位点(磷酸化位点 (phosphorylation site)、糖基化位点 (glycosylation site)、乙酰化位点 (acetylation site) 等),本身可以呈现多条带。

  • 样本处理过程中目的蛋白发生降解 (protein degradation): 加入蛋白酶抑制剂 (protease inhibitor);样本处理时在冰上操作; 避免/减少样本的冻融循环 (free-and-thaw cycle)。

  • 样本处理过程中目的蛋白发生聚集(protein aggregation):增加DTT的浓度;增长加热的时间。

  • 上样量(sample loading)/ 样本浓度过高:适当减少上样量/样本浓度。

  • 一抗是多克隆抗体 (polyclonal antibody): 特异性降低,可能与其他蛋白结合,建议换用单克隆抗体 (monoclonal antibody)。

  • 一抗/二抗不纯:纯化抗体;购买高纯度抗体。

  • 一抗或者二抗浓度偏高:降低抗体浓度,对抗体进行滴度测试 (titre test),选择最适宜的抗体稀释度。

  • 膜封闭不够/封闭液 (blocking buffer)不适合:延长封闭时间,增加封闭液的浓度;尝试不同种类的封闭液,对比结果后选出效果最佳的。

  • 洗膜不够彻底:增长洗涤时间;增加洗涤剂的浓度。

结果中无信号或显示信号弱:

  • 检测样本没有表达目的蛋白:选择表达量高的细胞作为阳性对照,用于确定检测样本是否为阴性。

  • 检测样本低表达目的蛋白:提高上样量/样本浓度,裂解液 (lysis buffer)中记得加入蛋白酶抑制剂。

  • 转移不完全或过转移:可以用丽春红(Ponceau S)染膜并结合考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue)染胶来确定条带是否成功转渍到膜上或是转移过度。根据结果可以适当调整转膜的时间和电流。

  • 抗体不能识别测试种属的相关蛋白:购买抗体前要认真阅读抗体说明书,确定是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。

  • 一抗孵育时间不足:建议放在4℃过夜结合。

  • 二抗与一抗不匹配:检查并且选择正确的针对一抗来源的种属的抗体。

  • 洗膜过度:洗膜时间不宜过长,加入的去垢剂 (detergent)不宜过强或过多,建议使用0.05-0.1%的弱去垢剂Tween-20。

图片来自网络,内容由BioEngX原创,转载请注明!


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作者: fiofiona

伦敦大学学院博士,研究方向VLP生产,微藻的基因工程



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