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【细节】实验中的“气泡君”

生物技术相关实验多是在液相中进行。液体中混入气体,很容易产生气泡。分子生物学等实验是非常精细的,很多时候这些不起眼的气泡会影响我们的实验结果。同时,有些实验过程中产生气泡却是正常的。这需要我们理解气泡产生的原理并做好分辨。一旦不利的气泡产生,需要进行干预以减少对实验结果的影响。 下面我们简单讨论一些基础实验过程中出现气泡的情况,以及出现气泡后可以采取哪些合适措施。

常规电泳过程

电泳是分子生物学实验室最基本的实验。实验过程可以简单分为凝胶的制备,点样,通电电泳,查看结果四个部分。

气泡在凝胶制备,点样以及通电时都会出现。在凝胶制备时出现的气泡的是不利的,这些气泡可能会影响到样品的迁移,因此需要尽量避免。点样过程中在样品孔内也有可能出现气泡,通常由于移液器使用不当导致,稍加注意即可避免。

电泳过程,通电以后,会看到电泳槽中有大量气泡出现。这些气泡是正常的,出现的气泡表明液体中有电流流过。有经验的实验员通过观察气泡,可以判断电泳进行的是否正常,电泳缓冲液是否需要更换等。

Western Blots

电泳过程中出现的气泡已经在前面进行了讨论。Western Blots操作中,电泳后需要进行转膜操作,这个过程中也有可能出现气泡。这些气泡会影响蛋白质的迁移,导致假阴性的结果或者会在膜上形成一些难看的点。

可以采取以下措施避免转膜过程中气泡的出现。

1.转膜前,将裁减好的滤纸和膜浸泡于电泳转移缓冲液中,驱除留于膜上的气泡。
2.在排列“三明治”时,可以用玻璃棒来回擀几遍,以排出胶和膜之间的气泡。

液相色谱操作过程

AKTA蛋白质纯化系统是当前蛋白质纯化过程中经常用到的全自动液相色谱系统,而高效液相色谱(HPLC)是实验中最常用的小分子分离检测仪器。从下图中可以看到,液相色谱系统包含有很多的管道。无论AKTA还是HPLC,都要保证管道中不能存在气泡。缓冲液中的气泡很容易造成泵的损坏,引起系统中压力失常。气泡的存在也会干扰检测器的正常使用,影响检测结果。

因此,对于用在色谱中的溶液(流动相),在使用前,需要进行除气处理。常用的除气的方法有下面几种。

1.冲入惰性气体,比如氦气。
2.超声除气。将容器置于超声装置中,打开超声仪器,超声波会释放溶液中的气体。
3.抽真空除气。将容器与真空泵链接的同时,用磁力搅拌子搅拌溶液,帮助释放溶液中的气体。
4.超声与抽真空同时使用。

有些HPLC中内置了除气装置(Degasser)。Degasser会在流动相进入色谱柱前,自动进行除气操作。有了degasser,可以省略手动除气的操作。

发酵过程

在大多数微生物发酵过程中,在通气条件下,培养液中会出现泡沫。形成的泡沫有两种类型:一种是发酵液液面上的泡沫,气相所占的比例特别大,与液体有较明显的界限,如发酵前期的泡沫;另一种是发酵液中的泡沫,又称流态泡沫,分散在发酵液中,比较稳定,与液体之间无明显的界限[1]。

起泡会带来许多不利因素,如发酵罐的实际装量与总容量之比的装料系数减少、氧传递系数减小等。泡沫过多时,影响更为严重,造成大量逃液,发酵液从排气管路或轴封逃出而增加染菌机会等,严重时通气搅拌也无法进行,菌体呼吸受到阻碍,导致代谢异常或菌体自溶[1]。

可以采用两种途径控制气泡[1]:

调整培养基中的成分(如少加或缓加易起泡的原材料)或改变某些物理化学参数(如pH值、温度、通气和搅拌)或者改变发酵工艺(如采用分次投料)来控制,以减少泡沫形成的机会。
采用机械消泡或消泡剂消泡这两种方法来消除已形成的泡沫。还可以采用菌种选育的方法,筛选不产生流态泡沫的菌种,来消除起泡的内在因素。

样品检测过程

我们经常会利用酶标仪(plate reader)检测96孔板内样品,比如蛋白质浓度测定或者细胞OD的测定等。在向孔内加入液体的过程中,经常会有气泡出现。这些气泡会影响分光光度计的光径长度(path length),从而严重影响最终的检测结果。

这些气泡是需要极力避免的。在使用移液器时,吸液推液速度不要过快。另外,推液过程尽量保证“枪头”尖部高于液面,这样可以避免气泡的出现。如果气泡出现了,可以利用加热的针(heated needle)进行刺破处理。

上面是几个常规实验过程中可能会遇到气泡的情况以避免气泡产生的操作建议。你在实验过程遇到过哪些“气泡君”呢?可以留言讨论哦。

参考文献

[1] 章冬梅, 泡沫对工业发酵的影响与控制, 化工设计, 2008, 18(1).

作者: 于浩然

本科及硕士毕业于天津大学,博士毕业于伦敦大学学院。现就职于浙江大学化学工程与生物工程学院,PI,博导。研究方向为蛋白质工程、生物催化剂、合成生物学等。



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