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荧光蛋白与发荧光的蛋白不一样

所有的蛋白都可以发出荧光,但并不是所有的蛋白都叫作荧光蛋白。就像”并不是所有的牛奶都叫特仑苏”一样(拜托~这一点都不一样好吗Orz)。

普通蛋白质发光原理

所有的蛋白都可以发出荧光吗?原则上是的。在蛋白质分子中, 能发射荧光的氨基酸有色氨酸(Trp )、酪氨酸(T yr) 以及苯丙氨酸(Phe)三种。个别蛋白质分子含有的黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD ) 也能发射荧光。Trp、Tyr 以及 Phe 由于其侧链生色基团的不同而有不同的荧光激发和发射光谱。其中 Trp 的荧光强度最大, Tyr 次之, Phe 最小。

上图是三种能发出荧光的氨基酸结构,可以发现,三种氨基酸都都属于芳香类氨基酸。发出荧光通常在 280 nm 或更长的波长被激发,如果想选择性的激发色氨酸,要选择295 nm的波长。 Phe 在 绝大多数实验条件下不被激发, 所以很少能观察到 Phe 的发射。因此,蛋白质的内源荧光主要来自 Trp 和 Tyr 残基。Trp 残基对微环境的变化很敏感, 并且大多数蛋白质都含有几个不同的 Trp 残基, 因而常作为内源荧光探针来研究溶液状态下蛋白质的构象。

普通蛋白质荧光的应用

色氨酸发出的荧光是如何根据微环境变化而变化的呢? 这个问题很有趣。当蛋白质处于折叠状态时,如果在蛋白质内部含有色氨酸,色氨酸周围的环境主要是疏水的,此时色氨酸发出的荧光的强度会很高,同时发出荧光的最大光强度在波长330 nm处。当蛋白质处在解折叠状态时,色氨酸完全暴露在溶液中,周围环境是亲水的,此时色氨酸发出荧光的强度会变低,同时发出荧光的最大光强度的波长会增大,移动到350 nm处(如下所示)。

上图是IgG样品在25 °C(蓝,绿)和90°C(红,紫)的荧光光谱。在低温时,蛋白质处在正常折叠状态;而当升高温度后,蛋白质发生了折叠。这些信息可以从发光光谱中很好的显示出来。将蛋白质置于不利环境,比如变性试剂,不同pH,不同温度下,即可利用荧光的信息研究蛋白质的构象变化,甚至测定蛋白质的解折叠温度等信息。

荧光蛋白发光原理【1】

为什么说并不是所有发光的蛋白都是荧光蛋白,这是因为荧光蛋白的发光原理是不一样的。

绿色荧光蛋白(GFP)是常用的荧光蛋白质之一,我们拿GFP举例说明一下。GFP是一个由238个氨基酸残基组成的蛋白,根据其晶体结构显示,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构,长420 nm,宽240 nm,由11个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成,桶的顶部由3个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于桶的大空腔内(如下图)。实验表明GFP荧光产生的前提是桶状结构完整性,去除N端6个氨基酸或C端9个氨基酸,GFP均会失去荧光。

荧光蛋白的发光原理是咋样的呢?GFP含有一个荧光发色团(上图球状显示),这个发色团由65至67位的三个氨基酸(丝氨酸-酪氨酸-甘氨酸)残基组成。当蛋白质链折叠时,这段被深埋在蛋白质内部的氨基酸片段,得以“亲密接触”,导致经环化形成咪唑酮,并发生脱水反应。在分子氧存在的条件下,发色团可进一步发生氧化脱氢,最终成熟,形成可发射荧光的形式。具体过程为:在 O2存在下,GFP分子内第67位甘氨酸的酰胺对第65位丝氨酸的羧基进行亲核攻击,形成第5位碳原子咪唑基;第66位酪氨酸的α2β键脱氢反应之后,导致芳香团与咪唑基结合,并最终自发催化形成对羟基苯甲酸咪唑环酮生色。

GFP需要在氧化状态下产生荧光,强还原剂能使GFP转变为非荧光形式,但一旦重新暴露在空气或氧气中,GFP荧光便立即得到恢复。一般来说弱还原剂并不会影响GFP荧光,中度氧化剂如生物材料的固定,脱水剂戊二酸或甲醛等对GFP荧光影响也不大。

荧光蛋白发光特性

GFP吸收的光谱最大峰值为395nm(紫外),并有一个峰值为470nm的副吸收峰(蓝光);发射光谱最大峰值为509nm(绿光),并带有峰值为540nm的侧峰(Shouder)。虽然450~490nm只是GFP的副吸收峰,但由于该激发光对细胞的伤害更小,因此通常多使用该波段光源(多为488nm)。

GFP荧光极其稳定,在激发光照射下,GFP抗光漂白(Photobleaching)能力比荧光素强,特别是在450~490nm蓝光波长下更稳定。类似的,GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高,抗光漂白能力强,因此更适用于定量测定与分析。由于GFP荧光的产生不需要任何外源反应底物,因此GFP作为一种广泛应用的活体报告蛋白,其作用是任何其它酶类报告蛋白无法比拟的。但因为GFP不是酶,荧光信号没有酶学放大效果,因此GFP灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白,比如萤火虫荧光素酶等。

荧光蛋白的应用非常的广泛(如上图),  已经应用于分子标记,体内示踪,信号转导,药物筛选等生物科研的各个方面。

荧光让我们能够检测分子的构象变化,也能让我们追踪化学反应…. 是科学研究的重要手段之一。与荧光相似,生物发光也常用在实验室中。与荧光不同,生物发光不需要激发光照射。感兴趣的童鞋可以看我们的往期的科普文章哦~

送你一条谢耳朵的发光鱼,你愿意养吗?

Reference

[1] https://www.loybio.com/biowiki/t2601/

作者: 于浩然

本科及硕士毕业于天津大学,博士毕业于伦敦大学学院。现就职于浙江大学化学工程与生物工程学院,PI,博导。研究方向为蛋白质工程、生物催化剂、合成生物学等。



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