一文详细了解双特异性抗体

目前癌症免疫治疗的有力工具包含单克隆抗体、肿瘤疫苗、免疫检查点抑制剂、CAR-T细胞免疫疗法以及双特异性抗体（BsAb）。尤其是CAR-T和BsAb作为抗肿瘤免疫疗法的新策略受到越来越多的关注。BsAb虽然在技术及产业上存在一些技术难点，但被当作肿瘤和癌症治疗的前瞻性药物，已经有大量的人员和资本在进行研究开发。

双特异性抗体简介

单克隆抗体主要通过结合单一的特异表位，起到一定的生物学作用，比如阻断蛋白相关作用、激活或调节受体功能。抗体的Fc片段还能起到诱导抗体依赖细胞介导的细胞毒作用或补体依赖的细胞毒作用。但是也限制了其在一些领域的应用，例如需要阻断多种信号通路的肿瘤、自身免疫疾病的治疗，以及由于病毒高突变率需要结合多抗原位点阻止病毒逃逸的感染类疾病的治疗。因此，双特异性抗体也就应运而生。

双特异性抗体是一种可以同时结合两种特异性表位或目的蛋白的人工工程化抗体，具有同时结合两个不同表位的能力，可以起到一些特殊的生物学功能。比如将效应细胞直接靶向肿瘤细胞，增强其细胞毒性，提高抗体选择性和功能性，共刺激或抑制受体，避免免疫逃逸机制进而改善治疗效果，与两种单克隆抗体药物联合用药治疗相比，BsAb也减少了药物开发和临床试验的成本。

双特异性抗体分类

双特异抗体利用DNA重组和蛋白质工程技术手段制备，根据组成部分的不同可以有多种构建方式，所以会有多种分类。如根据结构左右对称性分为对称结构和不对称结构，根据IgG分子的完整性分为完整抗体和类抗体片段，根据抗原结合区域的数量构型分为二价、三价、四价或更多的构型等。

在本文中，我们仅对含有Fc片段的BsAb（IgG-like BsAb）与不含Fc片段的BsAb（non-IgG-like BsAb）进行简单介绍。

IgG-like BsAb指抗体的IgG有Fc部分，具有Fc介导的效应功能，比如ADCC、CDC细胞毒作用及ADCP细胞吞噬作用等。这类抗体相对分子量较大，Fc片段有助于抗体后期的纯化，并提高其溶解性、稳定性。当然，Fc部分会与受体FcRn结合，增加抗体血清半衰期。

non-IgG-like BsAb指抗体缺乏Fc片段，仅通过抗原结合力发挥治疗作用，具有较低的免疫原性、易于生产、分子量小等特点，具有较高的肿瘤组织渗透性，具有更强的治疗效果。

在双特异抗体研发设计时，需要以临床治疗目的为基础，保证两对不同的轻链和重链正确偶合或配对，还需要保持每个单克隆抗体各自结合域的独立性，保证结合不同表位时不会产生空间位阻的干扰，同时还要求抗体分子易于用哺乳动物细胞进行表达，不需要复杂的蛋白修饰工艺。

双特异性抗体的制备方法

BsAb的制备主要有化学偶联、双杂交瘤细胞法、重组基因制备等方法。

化学偶联法 是最早出现的BsAb制备技术，通过化学偶联试剂将两个完整的IgG或抗体片段偶联成一种BsAb。这种技术快速简单，但容易破坏抗原结合部位，对抗体活性产生影响，并且制备过程中使用的交联剂在安全性和致癌性方面不确定。

双杂交瘤细胞法 是将2株不同的杂交瘤细胞通过细胞融合的方法合成双杂交瘤细胞株，再通过常规的杂交瘤筛选获得克隆细胞。因为两种杂交瘤细胞会产生2种重链和2种轻链分子，这些轻重链可以随机组合。这种技术产生的BsAb随机性大，效率低，但生物活性较好，结构稳定。随着技术的发展，Konck-in-hole技术可以有效解决异源抗体重链正确配对的难题。

重组基因制备法 利用基因工程技术对抗体进行改造，从而形成多种形式的双特异性抗体。这种技术可以减少轻重链的随机组合，并实现哺乳动物细胞表达。

由于化学偶联法和双杂交瘤融合法制备的抗体为鼠源性，具有较强的免疫原性，难以纯化，限制了其在临床上的应用，因此，重组DNA技术是目前制备BsAb比较常用的技术。

双特异性抗体制备难点

四个不同的多肽链随机组合会产生10多种不同的产物，而仅有一种产物是想要的BsAb，因此在抗体制备中会产生大量的副产物。这些副产物一般包括同源二聚体、缺失一条轻链的抗体、半抗体、重链聚合物、轻链聚合物、游离的重链和轻链。这些副产物在标准单抗制备中不常见，因此为BsAb制备的下游工艺提出很大的挑战。

尽管基因工程技术能够提要异源二聚体的生成，但仍然难以完全消除同源二聚化。常用的蛋白A层析难以将这些二聚体与目的BsAb分开。对于母体抗体在等电点或疏水性上有较大差异的BsAb，可以用离子交换、疏水交换和羟基磷灰石等方法进行分离。但对于差异较小的BsAb来说，就需要进行工程化改造了，比如等电点工程化、亲和工程化、scFv-Fc融合等。

双特异性抗体的重要优势

BsAb介导免疫细胞对肿瘤的杀伤，两条抗原结合臂，一条与靶抗原结合，一条与效应细胞上的标记抗原结合。后者激活效应细胞，使其靶向杀伤肿瘤细胞。比如现在批准上市的两个双特异性抗体都具有这个特征，catumaxomab能够靶向肿瘤表面抗原EpCAM和T细胞表面受体CD3，Blinatumomab可以同时结合CD19和CD3，两者都是通过激活并召集杀伤性T细胞，从而达到治疗肿瘤的目的。

BsAb能够同时结合双靶点，阻断双信号通路，发挥独特的或重叠的功能，有效防止耐药。受体络氨酸激酶（RTKs）是一类酶联受体，在细胞增殖过程中发挥重要的调节作用。RTKs在肿瘤细胞表面异常高表达，导致肿瘤细胞恶性增生，因此也是肿瘤治疗的重要靶点。

针对RTKs的单靶点单抗已在肿瘤治疗中得到广泛应用。但肿瘤细胞可以通过转换信号通路或通过HER家族成员或不同成员之间的同源/异源二聚体激活细胞内信号进行免疫逃逸。通过BsAb药物可以同时阻断两个或多个RTKs或其配体，可以减少肿瘤细胞逃逸，提高治疗效果。

BsAb具备更强特异性、靶向性和降低脱靶毒性。两个抗原结合臂结合不同的抗原，有效的增强了抗体对癌细胞的结合特异性和靶向性，降低脱靶等副作用。

BsAb还可以有效降低治疗成本，与单克隆抗体相比，BsAb具有更强的组织渗透率、杀伤肿瘤细胞效率和临床适应症，并且在剂量方面最低可以降为原来的1/2000，显著降低药物治疗成本。

愿景

双特异性抗体作为抗体药物领域的最新理念，被视为治疗肿瘤的第二代抗体疗法，同时检测集几种抗原或将抗原结合位点与测定标记物连为一体的能力，使得双特异性抗体成为生物医学、药理学和诊断学进一步研究的重要对象。

目前有数十个双特异性抗体正在进行临床开发，有更多的双特异性抗体分子正处在临床前研究阶段，且大部分已经进入临床阶段的双特异性抗体都应用在肿瘤治疗领域。从靶点来看，以PD-1/PD-L1、CTLA-4及HER2为靶点的项目居多，比如PD-1/CD47、PD-1/IL-10、PD-1/VEGF、CD47/VEGF等。

有多个BsAb正在开展用于治疗肿瘤的临床试验，其结构中多包含CD3抗原结合位点（用于募集T细胞到肿瘤细胞附近），另一个结合位点包括CD19、CD20、CD33、CD123、HER2、CEA，神经节苷脂GD2、PSMA、gpA33等等。另外，还有一些BsAb为：HER2/HER3、IL1α/IL1β、IL13/IL17、IL17A/IL17F和CD30/CD16A。

作为一种前瞻技术，其在产业化面临诸多挑战，如解决错配和纯化，改善下游工艺不稳定，保证双抗的稳定性和平衡两个抗体的表达量等。随着技术的进步，相信未来可以利用更多更好的策略来优化各种BsAb，使其具有更强大的疗效和更低的副作用，为肿瘤患者带去福音。

【参考文献】
1. Immunoglobulin Gamma-Like Therapeutic Bispecific Antibody Formats for Tumor Therapy.
2. Recent advances of bispecific antibodies insolid tumors.
3. Bispecific antibodies: a mechanistic review of the pipeline.
4. Bispecific antibodies.
5. Bispecific antibodies: design, therapy, perspectives.