您的位置 首页 生物信息技术

GROMACS蛋白配体模拟：配体使用amber GAFF力场

发布: 2020-08-20 1,658阅读 243评论

软件与材料

本文内容使用到如下软件：

  • Ambertools 20
  • GROMACS 2019.5
  • Gaussian 16

如果使用win10操作系统，可以自己编译前两个软件，也可以找别人编译好的版本。比如Ambertools、GROMACS2019.5；在此表示感谢。Gaussian 16 是要付费购买的，在本文中是用于计算配体的RESP电荷，RESP电荷还可以通过Multiwfn得到；配体还可以采用bcc电荷(准确性不如RESP)，可以直接用Ambertools计算得到。

本文还用到一个蛋白protein.pdb和一个从drugbank下载的配体小分子ligand.pdb。蛋白将利用GROMACS的力场处理，而配体将用amber的GAFF力场处理。

配体处理

配体加氢

本次下载得到的ligand.pdb文件里是没有包含非极性氢的，所以需要给它加氢。加氢的方式有很多，比如Ambertools里的reduce、或者pymol等。

reduce ligand.pdb > ligand_h.pdb

reduce 可能更适用于氨基酸组成的分子；不论使用什么软件进行加氢操作，最后一定要检查结果文件中是否包含了加上的氢。还需要检查加氢之后的结构是否合理，不合理的结构无法通过高斯进行计算。

之后通过Ambertools的antechamber处理成Gaussian的输入文件。

antechamber -i ligand_h.pdb -fi pdb -o ligand.gjf -fo gcrt -pf y
# 当然输入的配体文件也可以是mol2等
# antechamber -i liand_h.mol2 -fi mol2 -o ligand.gjf -fo gcrt -pf y

然后利用Gaussian 16 计算：

g16 < ligand.gjf > ligand.out

在Gaussian的输出文件中就有ESP电荷数据；利用antechamber得到包含RESP电荷的mol2文件：

antechamber -i ligand.out -fi gout -c resp -o ligand_resp.mol2 -fo mol2 -pf y

要在Ambertools中对配体应用GAFF力场，我们还需要生成一个输入文件：

parmchk -i ligand_resp.mol2 -f mol2 -o ligand.frcmod

ligand.frcmod中包含小分子的一些必要参数。

如此，我们所需要的的Ambertools输入文件就准备好了。

对配体应用GAFF力场

打开Ambertools中的tleap，输入如下命令：

# 载入力场
source leaprc.gaff 
# 载入配体参数化文件
loadamberparams ligand.frcmod 
# 载入配体
lig = loadmol2 ligand_resp.mol2 
# 检查配体
check lig 
# 保存amber输入文件
saveamberparm lig lig.prmtop lig.inpcrd

转换配体结构和拓扑文件到GROMACS格式

接下来我们需要将amber的输入文件转换为GROMACS可用的输入文件，也即top文件和gro文件。

通过Ambertools中的acpype程序进行转换：

# 输出帮助信息
# acpype -h 
# 做文件转换，输出文件名默认为Ambertools中unit的名字
acpype -p lig.prmtop -x lig.inpcrd

如此我们就得到了top文件和gro文件；配体的top文件还需要一点修改才可以被GROMACS使用。

构建模拟体系

生成蛋白质拓扑文件

我们已经有了蛋白文件protein.pdb，配体的top和gro文件；接下来首先要做的就是创建蛋白质的拓扑文件：

gmx pdb2gmx -f protein.pdb -o protein.gro -water spc -ignh
# 选择力场
# 这里选择amber99sb力场

然后我们在相应目录下就可以看到生成了protein.gro、topol.top、posre.itp。topol.top里面包含了选择的力场的一些参数以及蛋白质的拓扑结构参数等等。

接下来我们需要做一系列文件更改，来把配体加到我们的体系中。

拓扑文件修改

先说明本例子中各文件的修改步骤：

  1. 复制protein.gro并重命名为complex.gro
  2. 将配体的gro文件的坐标部分，复制到complex.gro的坐标部分后面，并相应修改第二行的原子数目
  3. 将配体的top文件重命名为ligand.itp
  4. 将pdb2gmx命令生成的topol.top文件重命名为protein.itp
  5. 新建文件topol.top
  6. 将protein.itp中[ moleculetype ]部分之前的内容完全剪切到topol.top
  7. 将protein.itp中[ dihedrals ]部分之后的内容完全剪切到topol.top，包括各种文件的导入部分、[ system ]以及[ molecules ]。
  8. 在topol.top中导入蛋白质位置限制文件的前面，导入蛋白质拓扑文件protein.itp
  9. 对照ligand.itp中最后的[ molecules ]，在topol.top中[ molecules ]部分添加配体的名字和数目；在topol.top导入水拓扑文件的前面导入配体拓扑文件ligand.itp。
  10. 删去ligand.itp中最后的[ system ]和[ molecules ]部分
  11. 适当修改topol.top中[ system ]的名字（这个可能无所谓）
  12. 对于ligand.itp中[ moleculetype ]前面的内容，我们也需要整合到topol.top中，一般包含两部分，[ defaults ]和[ atomtypes ]。对于这两部分内容，直接复制到topol.top文件中导入蛋白质拓扑文件部分的前面即可。
  13. 现在我们topol.top文件的最开始，是导入力场参数文件，之后就是配体的[ defaults ]部分，由于力场文件中通常也包含这一部分，所以会出错，将[ defaults ]部分注释掉；然后尝试对整个体系进行溶剂化、电荷平衡操作，如果不报错，可能就可以了，如果报错，那可能还需要进一步修改topol.top的力场部分。比如用配体的[ defaults ]部分置换掉力场的[ defaults ]部分等。
  14. 有关力场文件的详细信息，可参考jerkwin的博文，主要是5.7.1部分；在此表示感谢。

关于本体系中拓扑文件修改的详细情况，说明如下。

首先，在配体和蛋白质的拓扑文件（.top）中，主要包含如下几个部分的内容：

  1. [ defaults ]
  2. [ atomtypes ]
  3. [ moleculetype ]
  4. [ atoms ]
  5. [ bonds ]
  6. [ pairs ]
  7. [ angles ]
  8. [ dihedrals ]
  9. [ system ]
  10. [ molecules ]

前两个部分[ defaults ] 和[ atomtypes ] 主要是相应的力场参数的部分，后面的部分则定义了一些分子拓扑结构相关的参数以及系统参数。一般的itp文件的内容则主要包括3-8的部分，所以我们把ligand.top重命名为ligand.itp、pdb2gmx生成的topol.top重命名为protein.itp之后需要去掉多余的部分；但是去掉的部分并不是不需要的，这部分内容需要与体系的topol.top文件进行整合。

首先将protein.itp的1-2、9-10部分剪切到空白的topol.top中，并include蛋白质的itp文件，得到topol.top如下：

; Include forcefield parameters
#include "amber99sb.ff/forcefield.itp"

; Include protein topology
#include "protein.itp"

; Include Position restraint file
#ifdef POSRES
#include "posre.itp"
#endif

; Include water topology
#include "amber99sb.ff/spc.itp"

#ifdef POSRES_WATER
; Position restraint for each water oxygen
[ position_restraints ]
;  i funct       fcx        fcy        fcz
   1    1       1000       1000       1000
#endif

; Include topology for ions
#include "amber99sb.ff/ions.itp"

[ system ]
; Name
Protein

[ molecules ]
; Compound        #mols
Protein             1

然后我们需要将ligand.itp中的内容整合到topol.top中来。

首先是整合[ system ]和[ molecules ]部分，整合后的topol.top的这两部分如下：

[ system ]
; Name
Protein_and_ligand

[ molecules ]
; Compound        #mols
Protein             1
MOL                 1     
;主要就是添加了配体这一行，这里配体名为MOL

整合之后记得删除ligand.itp中的这两部分，并在topol.top导入水拓扑文件的前面导入ligand.itp。

然后整合ligand.itp的前两个部分到topol.top中，直接剪切并粘贴到topol.top导入蛋白质拓扑文件前面、导入力场的后面，然后注释掉[ default ]部分。

整合之后的topol.top如下：

; Include forcefield parameters
#include "amber99sb.ff/forcefield.itp"

; [ defaults ]
; nbfunc        comb-rule       gen-pairs       fudgeLJ fudgeQQ
; 1               2               yes             0.5     0.8333

[ atomtypes ]
;name   bond_type     mass     charge   ptype   sigma         epsilon       Amb
 c2       c2          0.00000  0.00000   A     3.39967e-01   3.59824e-01 ; 1.91  0.0860
 c1       c1          0.00000  0.00000   A     3.39967e-01   8.78640e-01 ; 1.91  0.2100
 os       os          0.00000  0.00000   A     3.00001e-01   7.11280e-01 ; 1.68  0.1700
 o        o           0.00000  0.00000   A     2.95992e-01   8.78640e-01 ; 1.66  0.2100

; Include protein topology
#include "protein.itp"

; Include Position restraint file
#ifdef POSRES
#include "posre.itp"
#endif

; Include ligand topology
#include "ligand.itp"

; Include water topology
#include "amber99sb.ff/spc.itp"

#ifdef POSRES_WATER
; Position restraint for each water oxygen
[ position_restraints ]
;  i funct       fcx        fcy        fcz
   1    1       1000       1000       1000
#endif

; Include topology for ions
#include "amber99sb.ff/ions.itp"

[ system ]
; Name
Protein_and_ligand

[ molecules ]
; Compound        #mols
Protein             1
MOL                 1

后续建模

通过GROMACS进行后续的建模，如果在添加离子等后续步骤中不报错的话，体系一般就是ok的。

gmx editconf -f complex.gro -o newbox.gro -bt cubic -d 1.0  
gmx solvate -cp newbox.gro -cs spc216.gro -p topol.top -o solv.gro  
gmx grompp -f em.mdp -c solv.gro -r solv.gro -p topol.top -o ions.tpr -maxwarn 2  
gmx genion -s ions.tpr -o solv_ions.gro -p topol.top -pname NA -nname CL -np 5

关于力场

这种体系中，小分子的力场最好选择和蛋白质的力场比较相近的力场；也即同一个体系中，所有的物质，最好都采用同一个力场或者同一类力场。本文中，GAFF力场和amber99sb算是同一类力场吧。

如果采用不同类型的力场（如假设本文中蛋白质采用GROMOS系列的力场），可能会有一些理论上的问题，请咨询相关的资深人员。

关于多配体体系

如果蛋白配体体系中需要有多个位置不同的配体，那可以通过pymol等工具，载入ligand_resp.mol2文件，通过复制移动等功能实现蛋白周围的不同位置配体的生成，然后分别保存每个配体为mol2文件。这样就可以得到多个有resp电荷的配体文件，但要注意：pymol等工具导出的文件中原子类型可能和ligand_resp.mol2中定义的「原子类型」不同了，需要对照ligand_resp.mol2文件对原子类型一列进行修改，才能与ligand.frcmod配合进行后续建模。之后再通过Ambertools处理，acpype转换。最后整合和include到体系中应该就可以了。

关注公众号蓝色火烈鸟，了解更多技术笔记和工具推荐：

1.11K赞
标签:



相关文章

回复 Jlmycn 取消回复

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注

评论列表(243)

  1. Этот увлекательный информационный материал подарит вам массу новых знаний и ярких эмоций. Мы собрали для вас интересные факты и сведения, которые обогатят ваш опыт. Откройте для себя увлекательный мир информации и насладитесь процессом изучения!
    Обратитесь за информацией – https://blackbritishbookfestival.com/2024/11/19/ya-writing-workshop-success

    回复

  2. Этот увлекательный информационный материал подарит вам массу новых знаний и ярких эмоций. Мы собрали для вас интересные факты и сведения, которые обогатят ваш опыт. Откройте для себя увлекательный мир информации и насладитесь процессом изучения!
    Неизвестные факты о… – https://emergency-support.domei.church/?p=190

    回复

  3. Этот информационный материал собраны данные, которые помогут лучше понять текущие тенденции и процессы в различных сферах жизни. Мы предоставляем четкий анализ, графики и примеры, чтобы информация была не только понятной, но и практичной для принятия решений.
    Получить полную информацию – http://innovation-systems.ru

    回复

  4. В этой информационной статье вы найдете интересное содержание, которое поможет вам расширить свои знания. Мы предлагаем увлекательный подход и уникальные взгляды на обсуждаемые темы, побуждая пользователей к активному мышлению и критическому анализу.
    Узнай первым! – http://www.worldwidecancernetwork.org/ecn-chosen-songs4childrens

    回复

  5. Этот информационный материал собраны данные, которые помогут лучше понять текущие тенденции и процессы в различных сферах жизни. Мы предоставляем четкий анализ, графики и примеры, чтобы информация была не только понятной, но и практичной для принятия решений.
    Полная информация здесь – https://faydeka.com/product/suit15

    回复

  6. В этом информативном тексте представлены захватывающие события и факты, которые заставят вас задуматься. Мы обращаем внимание на важные моменты, которые часто остаются незамеченными, и предлагаем новые перспективы на привычные вещи. Подготовьтесь к тому, чтобы быть поглощенным увлекательными рассказами!
    Заходи — там интересно – https://en.founyu.com.tw/hello-world

    回复

  7. Эта статья предлагает уникальную подборку занимательных фактов и необычных историй, которые вы, возможно, не знали. Мы постараемся вдохновить ваше воображение и разнообразить ваш кругозор, погружая вас в мир, полный интересных открытий. Читайте и открывайте для себя новое!
    Исследовать вопрос подробнее – https://www.breezeleeds.org/breeze

    回复

  8. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Посмотреть подробности – https://phucduclaw.com/can-bo-cong-chuc-co-duoc-ho-tro-on-dinh-doi-song-khi-bi-thu-hoi-dat

    回复

  9. Этот текст призван помочь читателю расширить кругозор и получить практические знания. Мы используем простой язык, наглядные примеры и структурированное изложение, чтобы сделать обучение максимально эффективным и увлекательным.
    Нажмите, чтобы узнать больше – https://komigang.nu/hej-verden

    回复

  10. Эта публикация дает возможность задействовать различные источники информации и представить их в удобной форме. Читатели смогут быстро найти нужные данные и получить ответы на интересующие их вопросы. Мы стремимся к четкости и доступности материала для всех!
    Переходите по ссылке ниже – https://co2florestal.com.br/2023/08/21/exploring-the-beauty-of-mother-nature

    回复

  11. Этот обзорный материал предоставляет информационно насыщенные данные, касающиеся актуальных тем. Мы стремимся сделать информацию доступной и структурированной, чтобы читатели могли легко ориентироваться в наших выводах. Познайте новое с нашим обзором!
    Углубиться в тему – https://printemps-des-migrations.org/2024/03/2024-20-avril-tournoi-de-poesie-slam-sur-le-theme-des-migrations

    回复

  12. Мы предлагаем вам подробное руководство, основанное на проверенных источниках и реальных примерах. Каждая часть публикации направлена на то, чтобы помочь вам разобраться в сложных вопросах и применить знания на практике.
    Подробнее – https://aata.mx/index.php/2024/02/29/hola-mundo

    回复

  13. Эта информационная заметка содержит увлекательные сведения, которые могут вас удивить! Мы собрали интересные факты, которые сделают вашу жизнь ярче и полнее. Узнайте нечто новое о привычных аспектах повседневности и откройте для себя удивительный мир информации.
    Все материалы собраны здесь – http://4x4markhot.ru

    回复

  14. Этот информативный текст отличается привлекательным содержанием и актуальными данными. Мы предлагаем читателям взглянуть на привычные вещи под новым углом, предоставляя интересный и доступный материал. Получите удовольствие от чтения и расширьте кругозор!
    Секреты успеха внутри – https://www.certificadogas.com/hola-mundo

    回复

  15. Этот информативный текст выделяется своими захватывающими аспектами, которые делают сложные темы доступными и понятными. Мы стремимся предложить читателям глубину знаний вместе с разнообразием интересных фактов. Откройте новые горизонты и развивайте свои способности познавать мир!
    Почему это важно? – https://178evakuator178.ru/?paged=37

    回复

  16. Эта публикация завернет вас в вихрь увлекательного контента, сбрасывая стереотипы и открывая двери к новым идеям. Каждый абзац станет для вас открытием, полным ярких примеров и впечатляющих достижений. Подготовьтесь быть вовлеченными и удивленными каждый раз, когда продолжите читать.
    Получить полную информацию – https://aceiling.ru/?paged=46

    回复

  17. Публикация приглашает вас исследовать неизведанное — от древних тайн до современных достижений науки. Вы узнаете, как случайные находки превращались в революции, а смелые мысли — в новые эры человеческого прогресса.
    Узнай первым! – https://f5fashion.vn/tong-hop-hon-69-ve-xe-honda-civic-2021-hay-nhat

    回复

  18. Публикация предлагает уникальную подборку информации, которая будет интересна как специалистам, так и широкому кругу читателей. Здесь вы найдете ответы на часто задаваемые вопросы и полезные инсайты для дальнейшего применения.
    Почему это важно? – https://computacao.pucpcaldas.br/imagem9_feira

    回复

  19. В этой статье собраны факты, которые освещают целый ряд важных вопросов. Мы стремимся предложить читателям четкую, достоверную информацию, которая поможет сформировать собственное мнение и лучше понять сложные аспекты рассматриваемой темы.
    Подробнее тут – https://mukeshsinghsite.com/website-development-and-services

    回复

  20. В этой статье представлен занимательный и актуальный контент, который заставит вас задуматься. Мы обсуждаем насущные вопросы и проблемы, а также освещаем истории, которые вдохновляют на действия и изменения. Узнайте, что стоит за событиями нашего времени!
    Подробная информация доступна по запросу – https://www.stop-multikulti.cz/easter-3-jpg

    回复

  21. Эта информационная статья охватывает широкий спектр актуальных тем и вопросов. Мы стремимся осветить ключевые факты и события с ясностью и простотой, чтобы каждый читатель мог извлечь из нее полезные знания и полезные инсайты.
    Получить больше информации – https://vyvod-iz-zapoya-1.ru/

    回复

  22. Этот информационный обзор станет отличным путеводителем по актуальным темам, объединяющим важные факты и мнения экспертов. Мы исследуем ключевые идеи и представляем их в доступной форме для более глубокого понимания. Читайте, чтобы оставаться в курсе событий!
    Ознакомиться с деталями – https://vyvod-iz-zapoya-1.ru/

    回复

  30. wonderful post, very informative. I wonder why the opposite specialists of this sector don’t realize this. You should proceed your writing. I’m sure, you’ve a huge readers’ base already!

    回复

  66. “I managed to lift nearly two hundred today. I believe.” He explains. “But I strained a lot to do it. I was moaning. Groaning.” Daddy gave me a look implying his shoes are needed to be removed. “Can I take off your loafers, daddy ?” I asked so quietly. He looked at me and nodded. I took off both his loafers and put them away neatly in front of me. Daddy then raised his right leg and stepped on my forehead, pushing me down into his loafers. It is a mixed smell with sweat, testosterone, and leather. I couldn’t help but take a big whiff every time I breathed. “Hands-on the floor” he commanded. He moved his feet from my head to my hands. “Kiss them and make the stink goes away using only your fag tongue.” “Yes sir.”

    回复

  69. Nicely put. Thanks!
    casino ph online [url=https://usacasinomaster.com/#]online casino free bonus[/url] gta online diamond casino heist big con

    回复

  70. Thanks a lot. I enjoy it!
    online casino zar [url=https://luckyusaplay.com/#]fastest payout online casino[/url] afun casino online

    回复

  71. “This is what a man looks like, son.” His father says as his pants fall to the floor. From his waist out pops his representation of a 40-year-old-man. And father of two teenage boys. His cock. [url=https://arturzasada.pl/]porn sex[/url] “Once you plant that cock of yours in some squirmy hole and empty those warm balls of yours into a moist wet hole. Then you are on your way to becoming a man, and only then will you, come-of-age. But it is only a step onto the winding pathway towards manhood. It is my job to teach you what it means to be a man.” His father stands as he finishes his sentence. Loosening his belt and pulling his shirt out from the tucked confines of his pants.

    回复

  72. You explained that superbly.
    casino online neuquen [url=https://luckyusaplay.com/#]best online casino no deposit sign up bonus[/url] vegas x org online casino

    回复

  76. You definitely made the point.
    articles on online casinos [url=https://uscasinoguides.com/#]online usa casinos[/url] lucky creek online casino reviews

    回复

  77. Really plenty of amazing tips!
    diamond casino gta online location [url=https://usaplayerscasino.com/#]casino bonus online[/url] online casinos reviews

    回复

  80. Awesome material, Appreciate it.
    deck media online casinos [url=https://usacasinomaster.com/#]biggest online casino[/url] pennsylvania online casino real money

    回复

  82. Incredible quite a lot of superb info!
    mejores promociones de casinos online [url=https://luckyusaplay.com/#]casinos gambling online[/url] best online casino for indian players

    回复

  84. You’ve made your point extremely effectively!!
    pagcor casino online [url=https://uscasinoguides.com/#]no deposit online casino bonus[/url] australian online casino neosurf

    回复

  86. Cheers. Numerous knowledge!
    xgames online casino [url=https://usaplayerscasino.com/#]new online usa casinos[/url] free online casino games no sign up

    回复

  87. Kudos. A lot of information.
    online casino las vegas slots [url=https://usagamblinghub.com/#]best usa online casinos[/url] versailles online casino

    回复

  89. Many thanks. Useful information.
    wind creek casino online promo code [url=https://usacasinomaster.com/#]best online casino no deposit sign up bonus[/url] rubyfortune casino online

    回复

  91. You stated that well.
    online casino promo no deposit [url=https://luckyusaplay.com/#]online casino free spins[/url] william hill online casino nj

    回复

  95. Cheers! Helpful stuff.
    online casino golden tiger [url=https://uscasinoguides.com/#]live casino online[/url] online casinos that accept discover card

    回复

  97. You explained that adequately.
    fortune casino online game [url=https://usagamblinghub.com/#]casino online casino[/url] fairgo casino online

    回复

  99. You actually stated this terrifically!
    21 blackjack online casino [url=https://usacasinomaster.com/#]usa online casino[/url] online casino japan legal

    回复

  101. Great stuff. Thanks.
    utländska online casino [url=https://luckyusaplay.com/#]online us casinos[/url] best zimpler online casino

    回复

  104. You reported that adequately.
    what is the best legit online casino [url=https://usaplayerscasino.com/#]brand new online casinos usa no deposit bonus[/url] panda master casino play online

    回复

  105. You mentioned this well!
    top paying online casino nz [url=https://usagamblinghub.com/#]biggest online casino[/url] casinos online disponiveis em portugal

    回复

  107. Regards! I enjoy this!
    most trusted online casino usa [url=https://usacasinomaster.com/#]best online casino bonus[/url] online casino topless dealer

    回复

  109. You actually revealed that perfectly!
    online casinos that pay real money no deposit [url=https://luckyusaplay.com/#]online casino free spins no deposit[/url] backgammon casino online

    回复

  114. Regards, Lots of facts.
    vegas rush online casino [url=https://usacasinomaster.com/#]casino online free[/url] top 3 online casinos

    回复

  115. Terrific postings. With thanks.
    best online casinos no deposit bonus [url=https://luckyusaplay.com/#]online casino bonuses[/url] poker stars online casino

    回复

  118. You expressed this very well!
    online casino juwa [url=https://uscasinoguides.com/#]online casino usa no deposit bonus[/url] http://www.casino club online

    回复

  119. Truly a lot of fantastic info!
    casino online vc [url=https://usagamblinghub.com/#]new online casinos usa real money[/url] online casino real payouts

    回复

  121. Very good data, Kudos!
    al’s casino online [url=https://usacasinomaster.com/#]online casino with no deposit bonus[/url] online casino.real.money

    回复

  123. Nicely put, Thanks a lot!
    ultra panda online casino [url=https://luckyusaplay.com/#]online casino[/url] como jugar casino online y ganar dinero

    回复

  125. Wow a good deal of valuable knowledge!
    online casino bingo games [url=https://uscasinoguides.com/#]online casino usa[/url] las vegas casino online review

    回复

  126. Fine info. Thank you.
    online casino slots ireland [url=https://usaplayerscasino.com/#]casino play online[/url] usa casino online slots

    回复

  128. You actually said that very well.
    free online poker casino games [url=https://usagamblinghub.com/#]social casinos online[/url] siti casino online sicuri

    回复

  130. Thanks a lot. Awesome information.
    steak online casino [url=https://usacasinomaster.com/#]usa casino online[/url] 123 bingo casino online

    回复

  132. You said it very well.!
    mejor hora para jugar casino online [url=https://luckyusaplay.com/#]online live casino[/url] dunder online casino login

    回复

  134. Factor very well utilized!!
    best dutch online casinos [url=https://uscasinoguides.com/#]online casino free bonus no deposit[/url] create online casino

    回复

  135. Amazing tons of helpful advice.
    online casino gratis speelgeld [url=https://usaplayerscasino.com/#]best paying online casino[/url] bogata casino online

    回复

  137. Nicely put, Thanks!
    real online casino reviews [url=https://usagamblinghub.com/#]casino games free online[/url] online casino ga

    回复

  139. Thanks a lot. Very good information.
    zimpler online casinos [url=https://luckyusaplay.com/#]live dealer online casino[/url] online casino winnings

    回复
联系我们

联系我们

(44)07934433023

在线咨询: QQ交谈

邮箱: info@bioengx.org

关注微信
微信扫一扫关注我们

微信扫一扫关注我们

关注微博
返回顶部