之前的文章中，小编简介过各种进阶版的PCR（详情点这里 ），也详说了进阶PCR的一种，colony PCR ，本期我们就来说说，另外一种进阶版PCR，巢式PCR （Nested PCR）。
为什么
PCR非常简单，最完美的PCR就是用设计的上下游引物完整地复制出目标片段。我们一般希望，在30-40个循环之后，产物几乎都是目标片段，然而现实不一定都是这样。如果上下游引物结合互补链的特异性不强，那么PCR产物有各种长度的片段，电泳结果就是弥散条带而不是我们期望的高亮而专一的条带。不纯的PCR产物会严重影响后续的克隆、筛选、表达等等实验结果。
怎么做
一张原理图
简单来说，第一级引物用于扩增包含目的片段的较长片段，这个较长片段就是所谓的巢片段，第二级引物用于扩增目标片段。从统计角度看，两对引物框定的片段有更小的可能性不是目标片段。小编一般的做法是，先加入一级引物进行正常的PCR反应，等到6-10个循环之后，再加入第二级引物，等到完成所有循环（30-35 cycles），即可回收产物了。建议使用第一级扩增的巢片段要比目标片段稍微长一些（比如长500 bp 或更长），这样产物回收的时候，就可以清晰分辨目标片段和巢片段了，毕竟我们想要的只有目标片段而已。
Extra tips
- BLAST搜索，弄清母板、巢片段、目标各是什么，这样在设计引物的时候就知道到底会不会存在非特异性结合；
- 更长的引物，长引物有更小的可能性会出现非特异性结合，同时也会提高退火温度；
- 引物的G+C含量，一般控制在40-60%，GC太低会导致引物结合能力不强，而出现各种飞特异性结合；
- 使用添加剂，稳定DNA模板和阻止可能存在的二级结构，各种添加剂功能和使用，请戳这里：PCR反应中各种添加剂的作用（上） ，PCR反应中各种添加剂的作用（下） 。
有什么关于巢式PCR的想法，欢迎下方留言讨论哦~
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