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一文了解质粒的常用组成元件

1952年,美国的生物科学家Joshua Lederberg第一次引进了质粒(plamid)这一术语,用来表示染色体以外的基因物质或。质粒是双链DNA片段,能够自我复制,并且通常携带基因[1]。20世纪70年代,随着限制性内切酶,DNA连接酶,凝胶电泳的发现与发展,质粒渐渐变成了分子生物学领域的重要工具,质粒也渐渐的开始被称为载体(vector)。利用质粒,科学家们不但可以很容易的操作并且研究基因,还可以利用质粒表达生产各种蛋白质。

今天科学家们所使用的质粒有各种各样的尺寸,功能也是多种多样。对于一个质粒,最简单的形式应该包括一个复制起始位点,一个抗性基因,至少一个酶切位点。这些元件可以保证质粒在细菌内的扩增,同时允许携带质粒的细菌从从不含质粒的细菌中进行分离。另外,限制酶切位点允许能够将DNA片段插入到质粒中。下面我们来看一下质粒中常见的一些元件[2]。

复制起始位点(Origin of replication,ORI)
ORI是一段DNA序列,质粒复制的起始位置。DNA解螺旋酶可以作用于这段序列,然后DNA的双链被分开,复制随即开始。质粒必须是能够复制的,否则随着细菌的生长,质粒的数量将会被迅速稀释。

抗生素抗性基因
抗生素抗性基因的存在有两个作用。质粒转化过程的效率其实是非常低的,平均10000个细胞中只有一个可以转化成功。如果没有一个快速的筛选手段,从10000个细胞中找到这一个,是要把人累死的。因此,抗生素抗性基因存在的第一个作用就是,快速筛选。在含有抗生素的培养基中培养细菌,能够生长的就是含有目的质粒,因为,不含质粒的细菌已经被“杀死”了。

另外,我们需要认识到一个事实,从细菌的角度来看,质粒的存在是不利的,因为细菌不得不消耗更多的资源来进行外来质粒的复制,所以转化成功的质粒有可能会丢失掉。抗性基因的另一个作用就是不断给转化成功的细菌施加压力,必须要携带质粒,否则就不能够在含有抗生素的培养基中生存,因此在培养转化成功的菌体时,不要忘了添加抗生素哦。

多克隆位点(multiple cloning site, MCS)
这是一段短DNA片段,包括多个限制性酶切的单一位点,便于外源基因的插入。一般来说,外源DNA片段越长,越难插入,越不稳定,转化效率越低。在表达型质粒中,MCS常处于启动子的后面。

启动子
启动子是能够使基因进行转录的一段DNA序列。启动子可以被RNA聚合酶辨别,并开始转录。启动子常位于目的基因上游100-1000bp位置处,是质粒非常重要的一个元件,它决定着目的基因可以在何种细胞中进行表达,也决定蛋白质的表达量。

RNA聚合酶催化DNA转录成RNA。在细菌中,只存在一种RNA聚合酶。然而,真核生物中则有RNA聚合酶Ⅰ、RNA聚合酶Ⅱ和RNA聚合酶Ⅲ三种不同酶,分别催化不同种类型RNA的合成,而且不同的酶识别不同的启动子。这就意味着,质粒上的启动子类型必须与目标RNA相互对应。如果为了基因表达,我们需要mRNA,那么质粒上就要有RNA聚合酶Ⅱ启动子。启动子也需要与宿主细胞类型相互对应,细菌启动子与真核启动子不可互用。

启动子还分不同的类型,有些启动子可以一直工作,而有些启动子是需要进行调控的。另外,启动子有强弱的区分,这会直接影响蛋白质的表达量。篇幅有限,我们只简单介绍。组成型启动子(constitutive promoter)就是一直工作的启动子,这类启动子用于组成型蛋白质的持续表达,不受时期、部分、环境的影响,这类启动子一般比较弱。诱导型启动子通常比较强,这类启动子受到外界条件诱导后开始工作。启动子的强弱主要跟其与RNA聚合酶相互作用的强弱或者RNA聚合酶量的多少有关系。强启动子常常直接或间接影响着RNA聚合酶的产量。

引物结合位点
一小段DNA片段,用来进行质粒的PCR扩增或者测序。

选择标记
抗生素抗性基因主要是细菌内质粒的筛选标记。对于其他的细胞类型,有些质粒上还会含有其他的选择标记。比如酵母中常用的营养缺陷筛选(auxotrophic selection)。营养缺陷型指的是生物不能够自主合成某种生长必需的有机化合物,这些生物能够在含有这种特殊化合物的培养基中生长,但在缺少这种化合物时不能生长。对于营养缺陷型的菌株,配合使用与之相对应的质粒,质粒中有能够合成这一物质的基因,含有质粒的菌株可以在缺少成分的培养基中生长,不含质粒的菌株则不会生长。

参考文献:
[1]Lederberg J (1952). “Cell genetics and hereditary symbiosis”. Physiol. Rev. 32 (4): 403–430. PMID 13003535
[2]http://home.sandiego.edu/~josephprovost/addgeneplasmidbook.pdf

作者: 于浩然

本科及硕士毕业于天津大学,博士毕业于伦敦大学学院。现就职于浙江大学化学工程与生物工程学院,PI,博导。研究方向为蛋白质工程、生物催化剂、合成生物学等。



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评论列表(1)

  1. 你好,
    谢谢你的文章分享.
    可以再介绍一下 质粒的 复制啊 转录 翻译的方向 的问题吗?

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