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细说小分子短肽标签(三)之Strep-Tag II

在分析蛋白质的结构和功能时,最重要的是如何得到高纯度的蛋白。现今最常用的方法就是亲和标签系统,已经成为重组蛋白检测和纯化中一个不可或缺的工具。不但如此,它还可能对目标蛋白的理化性质产生有利的影响,甚至可以提高重组蛋白的产量。亲和标签有多种不同的分类方法。根据分子量的大小,可分为“小分子短肽标签”和“蛋白质标签”两大类。小编特地为大家撰写了“细说小分子短肽标签”系列文章,希望能够帮助大家从众多蛋白标签中选择适合自己研究课题的。

第三篇文章要介绍的是同样使用很普遍的短肽亲和标签-Strep-Tag II。跟His-Tag和FLAG-Tag相似,它已经被广泛应用于大肠杆菌,酵母和哺乳动物细胞等表达系统中。Strep-tag II由8个氨基酸残基组成,序列是Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(W-S-H-P-Q-F-E-K)。因为它的分子量很小,只有1.06kDa,所以不会遮盖融合蛋白中其他的蛋白表位和结构域,更不容易改变融合蛋白的功能、分泌或是运输。

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在这个亲和标签的发现和设计上,科学家还走过一些“弯路”。最初,他们发现了自然界中链霉亲和素 (streptavidin)和生物素(biotin)具有极强烈的非共价相互作用(non-covalent interactions),而且生物学上的解离常数(dissociation constant)非常低,数量级在10−14 mol/L左右;即使生物素和其他蛋白质共价结合之后,也不影响它和链霉亲和素的相互作用。基于这两者之间强烈的相互作用,科学家运用一系列蛋白质工程手段,通过对短肽文库的筛选,设计了第一个链霉亲和素结合肽标签-Strep-tag。但是Strep-Tag和链霉亲和素结合时需要一个自由的羧基末端,所以这个标签只能位于目标蛋白的C端,很大的限制了它的应用范围。在第一代标签的基础上,通过大量合成短肽的筛选,终于获得了一个和一代相似、也是由8个氨基酸(W-S-H-P-Q-F-E-K)组成的链霉亲和素结合肽,就是Strep-Tag II,它可以位于融合蛋白的任意一端,弥补了最初的不足 (Terpe, 2003)。

不但如此,科学家们还通过蛋白质工程工程手段改进了链霉亲和素的蛋白序列,取名为Strep-Tactin。如此一来,Strep-tag与Strep-Tactin的结合力比天然的链霉亲和素要高至少100倍。这个亲和标签系统的纯化条件比较宽泛,不但在普通缓冲液(例如磷酸盐缓冲溶液, PBS)下可以和Strep-Tactin层析介质(resin)结合,而且使用2.5mM的脱硫生物素 (desthiobiotin)就可快速的将融合蛋白洗脱下来。溶液中如果带有螯合剂、去污剂、还原剂及高达1M的盐等等,也不会影响Strep-Tag II系统的效果。图一清晰明了的展示了使用Strep-Tag II 和Strep-Tactin提纯蛋白的过程。

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图1:使用Strep-Tag II 系统蛋白提纯示意图

从左到右:

1. 新的或是重新利用的Strep-Tactin 层析介质;

2. 带有Strep-Tag II 的绿色荧光蛋白(GFP)和层析介质的结合,其他的蛋白杂质将会被缓冲液冲洗掉;

3. 加入脱硫生物素后,将目标蛋白洗脱;

4-6. 层析介质柱的再利用的过程: 脱硫生物素会被黄色溶液HABA移除;一旦柱子变红,证明HABA与Strep-Tactin结合。用缓冲液再将HABA溶液去除,层析介质柱就可以重复使用。

蛋白提纯的整个过程简单又方便,而且检测的方法也多种多样。除了有针对Strep-Tag II的特异性抗体外,还有直接与HRP或是AP连结的Strep-Tactin。例如,在Western Blot中,通过直接法(direct method),就可以检测到目标蛋白的表达。图二就是这个实验过程的简易图,便于大家理解。不但如此,科学家还设计了Twin-Strep-Tag,进一步加强对目标蛋白检测的敏感度和定量的准确性。这个标签由30个氨基酸残基组成,序列是S-A-W-S-H-P-Q-F-E-K-G-G-G-S)2-G-G-S-A-W-S-H-P-Q-F-E-K。根据实验表明,仅一步提纯后的蛋白纯度就能达到99%。标签虽好,但毕竟这是一个分子量较大的蛋白残基,有可能会影响目标蛋白的溶解度或是特性,不一定适用所有表达系统或是目标蛋白。所以大家无论设计什么标签,都要根据自己的目标蛋白和实验目的出发。

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图2:用Strep-Tactin检测目标蛋白示意图

Reference:

【1】陈爱春, 彭伟, 汪生鹏 “亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用” 中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2012, 32 (12): 93-103

【2】http://www.iba-lifesciences.com/strep-tag.html

【3】http://www.iba-lifesciences.com/twin-strep-tag.html

【4】Terpe, K. (2003). Overview of tag protein fusions : from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems, 523–533. http://doi.org/10.1007/s00253-002-1158-6

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作者: fiofiona

伦敦大学学院博士,研究方向VLP生产,微藻的基因工程



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评论列表(2)

  1. 先赞一个 通篇看完一字不漏 基本了解了亲和标签蛋白纯化

    请问一下
    如果想详细了解标签亲和纯化可以看哪些教材或者参考书?谢谢。

    1. 可以看看这本教材,里面有所介绍。我当时读书时的教材。生物分离工程(孙彦)。

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