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细说小分子短肽标签(二)之FLAG-Tag

在分析蛋白质的结构和功能时,最重要的是如何得到高纯度的蛋白。现今最常用的方法就是亲和标签系统,已经成为重组蛋白检测和纯化中一个不可或缺的工具。不但如此,它还可能对目标蛋白的理化性质产生有利的影响,甚至可以提高重组蛋白的产量。亲和标签有多种不同的分类方法。根据分子量的大小,可分为“小分子短肽标签”和“蛋白质标签”两大类。小编特地为大家撰写了“细说小分子短肽标签”系列文章,希望能够帮助大家从众多蛋白标签中选择适合自己研究课题的。

第二篇文章要介绍的就是目前除了His-tag之外另一个使用很普遍的亲和标签-FLAG-tag。FLAG-tag被广泛应用于各种表达系统中, 例如大肠杆菌,酵母和哺乳动物细胞。FLAG-tag由8个氨基酸残基组成,序列是Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys (D-Y-K-D-D-D-D-K)。因为它的分子量很小,只有1.01kDa,所以不会遮盖融合蛋白中其他的蛋白表位和结构域,更不容易改变融合蛋白的功能、分泌或是运输。

标签序列中四个连着的天冬氨酸让整个标签具有天然的亲水特性(hydrophilicity)。这样一来,它就很容易定位在融合蛋白的表面,便于利用抗体来检测。值得注意的是,芳香环在抗原-抗体结合中具有很大的作用,所以这个标签的第二位残基特意设计的是酪氨酸(tyrosine)。因为FLAG-tag本身就具有免疫原型,所以它有3个特异性的单克隆抗体,分别是M1单抗,M2单抗,M5单抗。这就使得融合蛋白检测和提纯都变得很便利。但是实验表明FLAG-tag和特异性的抗体结合力没有His-tag和Ni2+-NTA或是其他一些亲和标签和检测系统的结合力那么牢固,融合蛋白的纯度只能达到90%左右 (Terpe,2003)。不过不要紧,大家还可以把三个FLAG-tag设计在一起(DYKDHDG-DYKDHDI-DYKDDDDK),增加和抗体的结合以及检测的敏感度。实验证明,3FLAG甚至能检测到飞量级的融合蛋白,比其他任何系统约高出20到200倍,特别适合于哺乳动物细胞表达系统中低表达水平蛋白质的检测 。

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与此同时,FLAG-tag含有一个肠激酶(enterokinase)的切割位点(D-D-D-D-K-X1)。实验证明X1这个氨基酸残基是影响肠激酶的切割效率的。恰巧赖氨酸(Lysine)在X1的位置时,切割效率达到了85%,仅次于丙氨酸 (alanine)和甲硫氨酸 (methionine)(Einhauer & Jungbauer, 2001)。通常情况下,FLAG-tag被放置在N端,通过肠激酶切掉后,就会还原融合蛋白的原始序列和结构。

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Reference:

【1】陈爱春, 彭伟, 汪生鹏 “亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用” 中国生物工程杂志 China Biotechnology, 2012, 32 (12): 93-103

【2】Einhauer, A., & Jungbauer, A. (2001). The FLAG e peptide , a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins, 455–465

【3】Terpe, K. (2003). Overview of tag protein fusions : from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems, 523–533. http://doi.org/10.1007/s00253-002-1158-6

【4】http://www.sigmaaldrich.com/life-science/proteomics/recombinant-protein-expression/purification-detection/flag-system.html

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作者: fiofiona

伦敦大学学院博士,研究方向VLP生产,微藻的基因工程



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