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细胞培养过程中,如何避免细胞污染

我相信很多看这篇文章的生物同行们都养过细胞,也应该都无数次的污染过细胞。绝大多数情况下我们很难分清我们的细胞是为什么会发生污染以及发生了什么污染(其他动物细胞/细菌/真菌等),我们能做的只是丢掉细胞甚至与之相关的全部培养用品。这里需要说明的是,即便我们在高倍镜下没有看出明显的污染,也不能保证实际上这瓶细胞是没有问题的,因为我们也加入了氢链霉素,即便有低水平的污染我们也难以发现,等到污染爆发后,我们就更难找到原因。针对细胞污染这一问题,笔者在这里谈一些自己的想法:

尽可能避免从非正规途径引进细胞:

在不清楚或者根本无法确认细胞是否发生污染的前提下应如何检查细胞是否污染了呢?解决这个的问题,可以用不含有双抗的培养基培养细胞一段时间,(以及有必要的话进行支原体检测,因为支原体不能直接被检测到)就能知道细胞是否发生了污染。同时也建议,各位童鞋不要为了一份细胞的钱造成培养基,血清,以及整体环境下污染风险的提高。

举个栗子:你从其他实验室,拿来了一瓶细胞无外乎两种可能性,养一段时间看到污染以及看不到污染。但是即便是看不见污染也不代表污染本身不存在。同时操作过程中即便专门为此细胞分装一部分培养基培养,但是生物安全柜内的气溶胶以及液体飞溅会把这种潜在的污染源带到整个台面上,而且并不容易清除,更不用说使用移液枪造成的气溶胶危害更大。而且我们很难保证这个实验台仅有你一个人使用(虽然我现在是一个人用一个台子,但是也会很害怕外面的细胞污染)所以这种危害是持续的和广泛的。

所以从正规途径引进细胞应该是最好的选择。

如果你必须要从非正规途径引进细胞,那么首先应该保证,引进方细胞本身是没有问题的,细胞传代代数不宜过长,否则很难知道这个细胞就是你要的细胞。另外,确保邮寄或者传递过程中使用全封闭的细胞培养瓶以及15ml离心管,外加多层封口膜和自封袋。最后,需要有完善SOP进行细胞引进后的检测。其实这样反而会花更多的精力和金钱,还不如从合适的公司里买一瓶。

血清的质量也许决定了你细胞养的好坏:

目前中国国内血清市场鱼龙混杂,很难买到真正放心的血清。在这里有钱的组当然是尽可能从公司直接订货。没钱的组就只好想办法买到较为便宜的血清。同样的,国内某品牌因为假货太多导致几乎我周围做细胞实验的都被它坑过,但是如果能找到正品的四季青血清的购买渠道也是一个物美价廉的好选择。

 我们实际上根本无法确保细胞培养环境的无菌程度:

从硬件来说:国内绝大多数细胞培养实验室都不是专门建立,墙面地面不一定能做到使用特殊材料建造,以满足不吸附灰尘杂质,同时可以承受氧化性消毒液经常的洗消;另外也很难做到使用正压房间和经过过滤的各个等级的换气系统。

从软条件(消毒方案)来说,紫外灯是我们常用的杀菌工具,但是事实上即便是双波长(紫外线本身的杀菌作用,以及另一专门激发臭氧的波长的杀菌作用)的紫外灯也并没有很好的杀菌效果。次氯酸也是常用的消毒试剂,但其效果也并不是很好。我们应该首先尽可能地确保桌面地面的干净(在这里推荐使用4%新洁尔灭拖地擦桌子仪器表面)。其次,空气的消毒也是很重要的,空气的消毒可以用来清洁我们所处理不到的各种缝隙和角落,在这里推荐使用过氧乙酸的稀释液,使用空气加湿器打成小液滴,这样比喷洒和挥发(熏蒸)要更有效果。

我们所忽略的污染源:

我们真正要确保的是我们的超净工作台以及生物安全柜内的物品是否无菌,台面内是否无菌,包括超净工作台打开太大的窗口和安全柜未打开到指定高度,各种恐怖的说话及打喷嚏,以及是否有可能发生滤膜长期不更换导致的空气不达标。

我们需要重新思考平时做实验的很多细节,比如瓶盖正反的放置,放置的高度;酒精灯是否发挥了实际作用;废液缸/瓶是否需要每次处理;是否定期更换超净工作台的过滤器(不是一个孔径很大的过滤灰尘的滤网)及生物安全柜的过滤器等。

我们的实验服真的干净无菌吗?如果做不到每次穿的实验服都是新的或者经过消毒无菌包装的,实验服实际并不太会有实际作用。在确保操作的生物安全的前提下,可以考虑将袖子挽起,使用含有乙醇的免洗手消毒液进行充分的涂抹,再戴上手套。每次伸进实验台里时均需在手中喷洒乙醇消毒(仅个人经验)

同时鞋套,帽子,口罩(即便是带了普通的口罩也不要小看喷嚏和说话的威力)等PPE设备必须穿戴。

 一种细胞,一瓶培养基,一份胰酶,一瓶PBS:

之前看到过一则报道,说有很多实验室或者细胞库里的细胞都被HELA细胞污染过。所以为了防止细胞之间的污染,以及防止其中有一瓶细胞污染导致全军覆没,笔者建议使用一份胰酶,一份PBS,一瓶培养基只培养一种细胞。曾经有这样的一个经历,在这里跟大家分享。在我刚开始养细胞的时候,有一次很长时间所有细胞都发生污染并且找不到原因,最后发现是大家共同取用的PBS发生了污染。另外,移液器,电动移液器都是非常强大的污染源,笔者曾专门自己花钱买了一套赛多利斯的移液器,移液器的口安装一个疏水的滤膜,实际酒精可以进去,这样每次用之前,使用酒精喷一喷晾干就好了。

使用哪一种培养用品更加划算?

我们常用的细胞培养瓶的表面均进行了特殊的处理(例如TC处理)。这种培养瓶针对的是贴壁细胞所设计的。如果多次使用胰酶消化,会使细胞不能很好的贴壁,目前我所得到的经验值是三次。建议采用带有0.22um过滤膜的细胞培养瓶,保证细胞在二氧化碳培养箱内不用稍稍拧开瓶盖。使用孔板或皿无法保证隔绝二氧化碳培养箱内的气溶胶污染,所以长期实验能在瓶子里就在瓶子里。如果是悬浮细胞就会更加容易,没有经过处理的各种培养用品的价格会稍稍便宜一些,而且在保证无菌的情况下也可以重复使用很多次。

小结:

作为进行了三年多细胞培养的童鞋,越来越多的惨痛的教训告诉我,即便你把环境搞成无菌的(曾经和老板商量在SPF里放一套细胞培养的设备。。),你自己才是最大的污染源。

操作的规范性,不慌张,不混用试剂才是我们细胞实验的最有力的保障。

 

作者: GuanlinGuo

西安文理学院(Xi'an University)本科在读。曾任西安文理学院基因工程实验室助理,建立细胞培养实验室SOP,SPF动物屏障系统SOP并拥有Charles River亚洲短期培训证书,陕西省动物从业人员资格证书。目前负责实验室SPF的动物屏障系统运营及NPG MICE 肿瘤模型构建。研究方向;小分子药物的抗肿瘤,天然产物提取物的抗炎活性,TCR-T的白血病治疗研究(目前),探针的动物体内及体外荧光活性(学科交叉)。



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