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单加氧酶不对称合成(R)-兰索拉唑和其他亚砜类药物

作者: 李新佳 发布: 2022-01-03 39阅读 28评论

DOI: 10.1007/s00253-021-11230-0

Applied Microbiology and Biotechnology (2021) 105:3169–3180

Feng Liu, ChaoShou, QiangGeng, Chen Zhao, Jianhe Xu, Huilei Yu

摘要：
近年来，手性亚砜药物的生物催化合成因其环境友好性而受到关注。然而，只有少数天然生物催化剂可用于亚砜药物的高效合成。(R)-兰索拉唑是一种手性亚砜药物，用于治疗胃肠道疾病手性质子泵抑制剂（PPI）。虽然已有几种酶被报道可用于埃索美拉唑（奥美拉唑的S-对映体）的生物催化，但没有一种可用于生产(R)-兰索拉唑。该课题组之前的研究发现的BoBVMO可以将兰索拉唑硫化物（LPS）氧化成(R)-兰索拉唑，具有出色的对映选择性，尽管活性极低且蛋白质表达较差（图1）。在本文研究中，为高效合成(R)-兰索拉唑和其他药物亚砜，BoBVMO的序列被用作同源搜索的模板，通过基因组挖掘来鉴定新的BVMO。经过虚拟序列的过滤、目标基因克隆、异源表达和兰索拉唑硫化物（LPS）单加氧活性筛选，在10,000多个同源BVMO中鉴定出7个新的BVMO。根据保守序列和系统发育树分析，这些发现的酶属于I型BVMOs家族和乙硫异烟胺单加氧酶亚型。其中，来自Cupriavidus basilensis的Baeyer-Villiger单加氧酶CbBVMO在将LPS转化为(R)-兰索拉唑方面表现出最高的效率和优异的对映选择性。此外，CbBVMO对其他大体积的拉唑族硫化物显示出广泛的底物谱。
                                                      图1  利用BoBVMO合成(R)-兰索拉唑
正文：
目标序列筛选

为了获得具有药物硫化物活性的潜在BVMO序列，文章首先使用NCBI的在线BLAST服务器输入天然BoBVMO的序列以搜索同源序列，获得超过10,000个与BoBVMO具有20-90%相似性的同源序列。为了减少实验时间，文章选择了949个序列，这些序列对应的63个基因组在本实验室中保藏。以90%的序列同源性为阈值过滤冗余序列以进一步缩小筛选范围，选定了142个蛋白进行异源表达。最终有68个BVMO在大肠杆菌BL21(DE3)细胞中成功表达。经过活性筛选，7个BVMO表现出LPS氧化活性，并产生具有优异对映选择性的(R)-兰索拉唑，e.e.值高达99%。

序列分析

所有七个鉴定的BVMO序列都包含两个相反的罗斯曼折叠基序GxGxx(G/A)，一个基序位于N末端附近，另一个位于序列的中间（图2）。

图2  7个BVMO序列比对

短序列基序FxGxxxHxxxW(P/D)在除了NnBVMO外的其他六种酶中是严格保守的（图2），这表明它们都是I型BVMO，这是一类NADPH和FAD依赖性酶，属于B类黄素蛋白单加氧酶。在N端罗斯曼折叠基序和I型BVMO指纹基序之间，另一个BVMO特异性基序[A/G]GxWxxxx[F/Y]P[G/M]xxxD在所有七个BVMO中也保守（图2）。PAMO中的Asp66（对应于CbBVMO中的Asp75）已被证明通过与NADP+辅酶直接相互作用在催化中起关键作用。将七个BVMO与其他研究良好的I型BVMO进行序列比对以生成系统发育树（图3）。

图3  7个BVMO与其他I型BVMO系统发育树

通过与其他经过充分研究的I型BVMOs比对发现，本文发现的BVMO都被分配到同一个单加氧酶（EtaA）簇。具有最高LPS转化率的三种BVMO：CbBVMO、RjBVMO、BcBVMO）得到了纯化，并进一步比较了它们对LPS的比活性、热稳定性和蛋白质表达水平。经过综合比较，CbBVMO（NCBI登录号WP_059411749.1）被选为(R)-兰索拉唑不对称合成的潜在生物催化剂。CbBVMO与其他具有晶体结构的BVMO之间的序列一致性小于28%。

CbBVMO的表征
以LPS作为底物，文章研究了温度对CbBVMO活性的影响。在30°C下观察到CbBVMO的活性最高。与BoBVMO最适活性pH 9.0不同，CbBVMO最佳pH值为8.0。此外，CbBVMO在7.5-9.5的pH范围内保留了其最大活性的90%，表明CbBVMO是更宽的pH适用范围的单加氧酶。CbBVMO在30°C下预孵育16小时的残留活性为31%。
脂肪酮、非芳香环酮、芳香酮和芳香硫化物化合物被用来探索CbBVMO的底物谱。结果表明CbBVMO对脂肪族酮的催化活性随着链长的增加而增加，对2-癸酮的比活性最高（1.47U/mg蛋白质）。当碳原子数增加到15时，比活性降低。当底物为2-庚酮时，产生两种酯（正常酯：异常酯=94：6，摩尔比），当底物空间位阻增加时，CbBVMO显示出优异的区域选择性，只生成正常脂。使用非芳香环酮和芳香酮作为底物时未检测到活性，包括环己酮、环辛烯酮、苯乙酮、4-羟基苯乙酮、4-羟基苯丙酮和戊苯酮。在芳香族硫化物化合物中，包括苯硫醚、4-甲硫基苯甲醚、4-氯苯硫醚、4-氟苯甲硫醚、4-硝基苯硫醚、4-羟基苯甲硫醚和乙基苯硫醚，只有苯硫醚可以被CbBVMO氧化，得到(S)-亚砜产物，e.e.值61%。这些结果表明CbBVMO更倾向于将中链和长链脂肪族酮转化为相应的酯，具有良好的区域选择性。

CbBVMO对LPS的比活性为39 mU/mg，远高于BoBVMO的0.69 mU/mg。除了LPS，其结构类似物（硫化物S1-S11）作为拉唑族亚砜的前体，也被当作CbBVMO潜在底物催化不对称亚砜化。如图4所示:

图4   拉唑族硫化物

结果表明：所有测试的大体积拉唑族硫化物都能被氧化成相应的手性亚砜，具有更高的比活性（与LPS相比）和优异的对映体选择性（~99%，ee）。其中，底物S2、S8、S9和S11的产物均为(R)-构型，而其他产品的绝对构型尚未确定。值得注意的是，底物LPS、S2、S8和S9分别是兰索拉唑、奥美拉唑、泮托拉唑和雷贝拉唑的前体，它们是最畅销的几种PPI。
文章还在10mM酶浓度，10mL反应规模下，测试了CbBVMO催化LPS、S2、S8和S9不对称亚砜化。所有四种大体积的拉唑族硫化物均成功转化为相应的(R)-亚砜，具有较高转化率和优异的对映纯度(≥99% ee)，这与报道的大多数其他生物催化剂的立体化学构型相反，也是最有效的报道了(R)-兰索拉唑的生物合成实例。这些结果表明，CbBVMO是一种很有前途的生物催化剂，可用于手性拉唑家族亚砜的酶促合成。
尽管CbBVMO在(R)-兰索拉唑等药物亚砜(PPI)的生物催化合成方面表现出巨大潜力，但需要指出的是，CbBVMO的催化效率仍处于较低水平。这个问题可能会通过蛋白质工程和反应工程得到妥善解决，且正在论文作者的实验室中进行。总之，新发现的天然CbBVMO对庞大的拉唑族硫化物的不对称亚砜化表现出优异的性能。
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