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DNA分离与提纯-苯酚抽提法

在之前的文章中,小编给大家简介了四种提纯DNA的方法(历史文章点这里),分别是苯酚/氯仿抽提法、乙醇沉降法、硅胶柱吸附法和磁珠吸附法。其中,关于硅胶柱吸附法,也有过详细介绍(点这里),那么,今天小编就来说说苯酚抽提法。


苯酚抽提法非常简单,而且十分常见。特别是在提取基因组DNA时,要去掉许多从细胞裂解液中带来的蛋白,苯酚法十分好用。

苯酚抽提的基本步骤

  1. 将同体积的苯酚和(DNA+蛋白)混合物溶液混合;
  2. 苯酚和水溶液不互溶,所以分层,水层在上,苯酚层在下。快速震荡,让两层充分混合;
  3. 静置让两液层分开,分离水层,在水层中得到的应该是大量的DNA和可能少量的蛋白质。

 

基本原理

最核心的原理是水和苯酚作为有极性差异的溶剂,对DNA和蛋白质有不同的溶解能力。因为水分子中的氧原子有更强的电负性,共用电子对向氧原子偏离,产生了看似略带负电的氧原子端和略带正电的氢原子端,所以我们说水是很有极性的溶剂(如下图)。苯酚也有极性,但不像水分子那么明显,因为苯环也有电负性,所以苯酚的氧原子并不能太强吸引周围的电子(如下图)。

20160104-1

有一点我们是清楚的,DNA可溶于水,原因就是DNA也是有极性的分子(如下图,DNA分子的糖-磷骨架上的磷酸基团是带负电的)。对于一物质是否水溶,我们基本可以总结出:有极性(polar)=亲水性(hydrophilic)=可溶;无极性(non-polar)=憎水性(hydrophobic)=不溶

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还有一点我们也是清楚的,细胞液环境是水环境,里面到溶解着各种蛋白质。蛋白质作为长链氨基酸,在形成有效结构的时候,外表面多是有极性的亲水类氨基酸(如谷氨酸、Glu;赖氨酸、Lys和组氨酸、His),内核多是没那么有极性的憎水类氨基酸,所以能够稳定的存在于水溶液中。

但是,在苯酚抽提法中,蛋白质在水中的溶解度被改变了。水溶液作为极性溶剂,导致了蛋白质的极性氨基酸在外,而没那没有极性的氨基酸在内;苯酚的到来,使得这些没那么有极性的氨基酸有了出头之日,他们被翻了出来,而那些有极性的氨基酸则被塞进蛋白质内核,以适应苯酚溶剂(基本原理如下图所示)。这样一来,变性的蛋白进入苯酚层,DNA则停留在水层。这也是为什么,有机溶剂会让蛋白质变性,因为不可逆地破坏了蛋白的整体结构。

20160104-3苯酚抽提的过程和蛋白质变性原理


苯酚抽提,简单有效,只是苯酚有毒,操作的时候要小心哦!小伙伴们对DNA提纯有想法或心得,请在下方留言,欢迎讨论!

图片来自网络,其余文字部分为BioEngX原创,转载请注明!


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作者: 卢阳

伦敦大学学院博士,研究方向为生物催化和细胞色素P450开发;BioEngX创始人之一。知乎主页:簏岩。



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