简介:
血球计数板（haemocytometer）是一种很常见的生物学工具，相信在做微生物、细胞培养等方面研究的小伙伴一定不陌生。它除了被用于对人体内红、白血球进行显微计数之外，也常常用来计算一些细菌、真菌、酵母等微生物的数量。今天小编就给大家详细介绍一下血球计数板的使用和计算方法。
血球计数板是19世纪法国解剖学家（anatomist）Louis-Charles Malassez 最先发明的，当时他用来计量血细胞。由图1 可见，血球计数板是一块特制的厚型载玻片（thick glass microscope slide），中间有四条垂直的槽沟，形成了三个分开的平台。中间的平台又被分成两半，很像H形，每个半边上面各刻有小方格网，称为上、下计数池（top & bottom counting chamber）。方格网的尺寸是已知的，所以先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。
图1：一款常见的血球计数板
点样:
在使用前，大家一定要用擦镜纸（lens paper）仔细除去血球计数板（载玻片）和盖玻片（coverslip）上的灰尘颗粒。这里提到的盖玻片比平时大家用于显微镜的普通盖玻片要厚，这是为了克服液体的表面张力（surface tension）而特意设计的。在确定盖玻片放好在H形平台之后（小编亲测，哈哈气最管用），把吸管尖（pipette tip）平稳的放在计数池的V形凹槽内，缓慢的推出细胞样品（如图2所示）。在毛细现象（capillary action）的作用下，盖玻片底下的区域会被样品覆盖。通常10 µl 左右液体就足够覆盖半个计数池，注意不要点样过多。上、下计数池可以点同一个样品或是不同样品，看大家的需要。小编一般会点上相同的样品，这样计量的数据更可靠。
图2：在血球计数板上点样
点样之后，大家就可以把它平稳的放在显微镜的载片台（microscope stage）上。这个时候就不要再碰盖玻片了，否则气泡的产生会对准确计量造成一定的困难。显微镜的使用小编在这里就不多做介绍了，相信每个实验室都有自己熟悉的实验步骤和方法。
计算：
由图3所示，计数池一共由9个大的正方格组成，每一个的面积为1 mm2。其中最中间的正方格（被称为计数区）由25个中方格组成，而每个中方格又被分为16个小方格。另外一种的划分略有不同，计数区被分为16个中方格，而每个中方格又分成25个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，就是计数区一共由400个小方格组成。在数细胞前，一般要制定一个规矩，例如只计入压在小正方格上线和左线的细胞，而不计入下线和右线的细胞，这样可以避免重复计量而过高估计（overestimate）细胞的数量。
图3：计数池的划分
大家需要适当稀释样品，这样细胞才能均匀分布在计数池上，不会出现互相重叠而导致数据不准确的情况。根据实验经验，应该保证每次数的细胞数量至少在100个以上，才是具有统计意义的数据（statistically significant）。
图4：血球计数板正面图和侧面图
计数区边长为1mm，所以面积是l mm2，每个小方格的面积是1/400 mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度是0.1 mm （由图4侧面图所示），所以一个计数区的体积是0.1mm3 或是100 nl。也就是说大家从计数区数出的细胞数量是体积为100 nl（10-4 ml）的样品的。通过以下公式就可以换算出每毫升细胞的数量了：
总细胞浓度 （细胞/ml）=
当然，以上方法是针对较小的细胞；对于稍微大一些的细胞的话，大家可以选择计数池四个角落的方格和最中间的方格同时计量，但要记得在计算过程中除以方格的数量。如果细胞再大的话，也可以考虑使用其他计数板，例如赛吉计数筐（Sedgwick-Rafter Cell Counting Chamber）。
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