您的位置 首页 技术频道

ELISA老不成功，究竟错在哪儿？

发布: 2018-03-14 1,443阅读 216评论

ELISA素来以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上得到了广泛的应用。而它作为经典的免疫检测方法，虽然看似平常但是要真正将该实验做好并不容易，酶标板的读值总是会不尽如人意，可见实操中的各个环节对该实验的检测效果影响较大，如不注意，就会产生一些糟心的实验结果。

问题1: 低信号强度

如果ELISA读数低于吸光度下限（<000），且目标样本浓度超出标准曲线范围，则进行分析的样本浓度可能太低，或者仪器所能分析的样本检测最佳条件可能未被满足。在这种情况下，样本所产生的检测信号应该需要被级联放大。

解决方案：

1.增加抗体的孵育时间。如果依照protocol在室温下孵育您的抗体2小时后的实验结果并不理想，那么可以尝试在4°C孵育过夜。如此，可允许抗原抗体最大程度上的结合，并能扩大ELISA中的反应信号。

2.增加二抗-酶结合物的浓度。ELISA中的E代表酶（通常是辣根过氧化物酶，HRP），它与底物（通常是TMB）反应后可产生鲜艳的蓝色。因而，将HRP浓度提高50％或将其加倍，则会产生更强的颜色，易于检测。

3.充分避光，以保护TMB基质不受光照影响，并确保其能最大限度地发挥其性能。考虑到TMB对光线非常敏感，因而在黑暗中进行ELISA平板的显色反应会产生更强的信号。

问题2: 高背景

ELISA板上的空白孔通常被用作为阴性对照，当该组中任意孔的读数明显大于0，这均表示实验背景有问题。

解决方案：

1.室温过高，可能会导致实验结果偏高。因而，如果发现所有的实验孔的读数均偏高，请注意控制恒温箱温度，尽可能将其稳定在37℃左右。

2.平板孔内因清洗不彻底，而导致有酶或底物残留，同样会产生高背景。此时需要按照protocol对ELISA平板进行清洗，可不任意减少洗板液的体积以及洗板次数，同时也需要按要求操作，并适当延长清洗液浸泡孔的时间。

3.加样或加酶时导致了阴性孔的污染。此时需要及时更换吸头以避免造成污染，切忌侥幸心理。

4.试剂过期或被污染。实验操作过程中不要使用过期试剂，并防止组分污染。如使用容器时，应注意容器的清洁。

问题3: 重复性不好

同一个样本间的各个复孔的读数有显著性差异。

解决方案：

1.加样量多少不一，操作时间长短不一。重复同一样本时，加样量与加样时间理应相同，同时也应注意移液器的校准。加样后可轻微晃动酶标板使反应液充分混合。

2.样本应保证一致、无污染，并应该由同一名操作人员进行操作。

3.精密度测定方法不标准，此时理应采用正确的方法进行操作。

问题4: 干扰

干扰物质如清洗剂或NADH（存在于血清中）可能会影响ELISA平板的吸光度读数并使得实验结果偏离真实结果。

解决方案：

1.严格按照protocol进行实验操作。通常protocol中会指出会对实验产生干扰的化学物质，以及会告知实验者如何避免它们。比如在进行血红蛋白干扰的血清测定中，通常会建议不要使用溶血的血清样品。

2.有时可能你也别无选择，只能使用含有干扰物质的样品。如果你感兴趣的抗原浓度较高，可以使用一个浓度较低但仍易于检测的样品稀释液，如此可以稀释样本中的干扰物质并降低其对实验的干扰。

问题5: 阳性与阴性不能达到2.1的比值

阴性颜色太深，又或者阳性颜色太浅。

解决方案：

1.当阴性颜色太深时，则阴性对照（也就是阳性对照的除目标抗原外的其它成分）中可能有某种成分与一抗作用。此时可通过纯化抗原除去干扰成分。

2.当阳性颜色太浅时，原因可能有3个：一抗效价不好，换用一抗或增加一抗用量；抗原太稀，增加抗原浓度；封闭时间过长，应缩短封闭时间，封闭时间一般37摄氏度2个小时，或者4摄氏度过夜。

问题6: 增加抗原浓度，一抗浓度不变，显色反应没有表现出应有的梯度

一抗与抗原的比例已经饱和。

解决方案：

增加一抗用量; 或在一抗用量不变的情况下减少抗原浓度做梯度。

问题7: 增加一抗浓度，抗原浓度不变，显色反应没有表现出应有的梯度

一抗与抗原的比例已经饱和。

解决方案：

增加抗原用量；或在抗原用量不变的情况下减少一抗浓度做梯度。

问题8: 加完TMB显色后颜色梯度很明显，但加了硫酸终止反应后颜色梯度没有那么明显了

硫酸可能把其它成分都炭化了

解决方案：

加少一点硫酸，参考值：50 μlTMB+35 μl硫酸；或者采用1M的HCL作为终止液，50ulTMB+50ul1M HCL。

1.34K赞
标签:



相关文章

回复 AwinitaEngar 取消回复

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注

评论列表(216)

  1. Эта статья предлагает живое освещение актуальной темы с множеством интересных фактов. Мы рассмотрим ключевые моменты, которые делают данную тему важной и актуальной. Подготовьтесь к насыщенному путешествию по неизвестным аспектам и узнайте больше о значимых событиях.
    Следуйте по ссылке – http://oxihom.com/2020/01/13/brevity-is-the-soul-of-knit

    回复

  2. Этот информационный обзор станет отличным путеводителем по актуальным темам, объединяющим важные факты и мнения экспертов. Мы исследуем ключевые идеи и представляем их в доступной форме для более глубокого понимания. Читайте, чтобы оставаться в курсе событий!
    Изучить вопрос глубже – https://f5fashion.vn/chi-tiet-voi-hon-51-ve-cong-ty-to-chuc-sinh-nhat-hay-nhat

    回复

  3. В этой статье представлен занимательный и актуальный контент, который заставит вас задуматься. Мы обсуждаем насущные вопросы и проблемы, а также освещаем истории, которые вдохновляют на действия и изменения. Узнайте, что стоит за событиями нашего времени!
    Только для своих – https://f5fashion.vn/thoi-trang-dien-anh-helen-rose-ba-tien-kin-tieng-am-tham-tao-nen-phep-mau-cho-hollywood

    回复

  4. Этот текст сочетает в себе элементы познавательного рассказа и аналитической подачи информации. Читатель получает доступ к уникальным данным, которые соединяют прошлое с настоящим и открывают двери в будущее.
    Выяснить больше – https://f5fashion.vn/trai-nghiem-xe-khach-vip-royal-tuyen-ha-noi-lao-cai-sapa

    回复

  5. Предлагаем вашему вниманию интересную справочную статью, в которой собраны ключевые моменты и нюансы по актуальным вопросам. Эта информация будет полезна как для профессионалов, так и для тех, кто только начинает изучать тему. Узнайте ответы на важные вопросы и расширьте свои знания!
    Более подробно об этом – https://f5fashion.vn/noi-nao-don-binh-minh-dau-tien-tren-trai-dat

    回复

  6. Эта статья для ознакомления предлагает читателям общее представление об актуальной теме. Мы стремимся представить ключевые факты и идеи, которые помогут читателям получить представление о предмете и решить, стоит ли углубляться в изучение.
    Более подробно об этом – https://www.rolfing-planet.jp/2017/09/01/9%E6%9C%88

    回复

  7. В этом информативном тексте представлены захватывающие события и факты, которые заставят вас задуматься. Мы обращаем внимание на важные моменты, которые часто остаются незамеченными, и предлагаем новые перспективы на привычные вещи. Подготовьтесь к тому, чтобы быть поглощенным увлекательными рассказами!
    Секреты успеха внутри – https://vanyaholidays.in/muktinath-yatra-from-gorakhpur

    回复

  8. Этот текст сочетает в себе элементы познавательного рассказа и аналитической подачи информации. Читатель получает доступ к уникальным данным, которые соединяют прошлое с настоящим и открывают двери в будущее.
    Изучить вопрос глубже – http://gamemt.net/index.php/2025/02/08/e6-max-%E4%BA%A7%E5%93%81%E4%BB%8B%E7%BB%8D

    回复

  9. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Лучшее решение — прямо здесь – https://katakana-sushi.ru

    回复

  10. Мы собрали для вас самые захватывающие факты из мира науки и истории. От малознакомых деталей до грандиозных событий — эта статья расширит ваш кругозор и подарит новое понимание того, как устроен наш мир.
    Секреты успеха внутри – http://globalcolor.cl/reinterprets-the-classic-bookshelf

    回复

  11. Этот информативный текст отличается привлекательным содержанием и актуальными данными. Мы предлагаем читателям взглянуть на привычные вещи под новым углом, предоставляя интересный и доступный материал. Получите удовольствие от чтения и расширьте кругозор!
    Все материалы собраны здесь – https://kaltenholzhausen.de/hello-world

    回复

  12. Gwarantujemy wszechstronną obsługę transakcji finansowych, przystosowaną do wymagań polskich użytkowników. Udostępniamy szeroką gamę opcji doładowań oraz wypłat, zapewniając ochronę i ekspresowość operacji.

    http://www.agisko.pl/

    回复

  13. Этот информативный текст выделяется своими захватывающими аспектами, которые делают сложные темы доступными и понятными. Мы стремимся предложить читателям глубину знаний вместе с разнообразием интересных фактов. Откройте новые горизонты и развивайте свои способности познавать мир!
    Ознакомиться с полной информацией – https://jmpoland.pl/2023/12/10/hello-world

    回复

  14. Этот информационный материал собраны данные, которые помогут лучше понять текущие тенденции и процессы в различных сферах жизни. Мы предоставляем четкий анализ, графики и примеры, чтобы информация была не только понятной, но и практичной для принятия решений.
    Перейти к статье – http://russianicons.ru/order.php?obj=94

    回复

  15. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Почему это важно? – https://dichvudangkiem.sauto.vn/cac-tuyen-duong-ha-noi-cam-xe-oto-tu-24-01

    回复

  16. Эта публикация дает возможность задействовать различные источники информации и представить их в удобной форме. Читатели смогут быстро найти нужные данные и получить ответы на интересующие их вопросы. Мы стремимся к четкости и доступности материала для всех!
    Узнать напрямую – http://med-pharmaque.ru

    回复

  17. Этот информативный текст выделяется своими захватывающими аспектами, которые делают сложные темы доступными и понятными. Мы стремимся предложить читателям глубину знаний вместе с разнообразием интересных фактов. Откройте новые горизонты и развивайте свои способности познавать мир!
    Смотрите также… – https://goldendigitalgroup.co/2020/08/25/construction-industry-as-their-over-draft-4

    回复

  18. В этой статье вы найдете познавательную и занимательную информацию, которая поможет вам лучше понять мир вокруг. Мы собрали интересные данные, которые вдохновляют на размышления и побуждают к действиям. Открывайте новую информацию и получайте удовольствие от чтения!
    Переходите по ссылке ниже – https://happyfishes.ru/product/315351

    回复

  19. Этот информационный материал собраны данные, которые помогут лучше понять текущие тенденции и процессы в различных сферах жизни. Мы предоставляем четкий анализ, графики и примеры, чтобы информация была не только понятной, но и практичной для принятия решений.
    Полная информация здесь – https://shopconfi.com/product/biogard

    回复

  20. Этот информативный текст отличается привлекательным содержанием и актуальными данными. Мы предлагаем читателям взглянуть на привычные вещи под новым углом, предоставляя интересный и доступный материал. Получите удовольствие от чтения и расширьте кругозор!
    Практические советы ждут тебя – https://yadunewsnation.in/nation/10536

    回复

  21. В этой статье представлен занимательный и актуальный контент, который заставит вас задуматься. Мы обсуждаем насущные вопросы и проблемы, а также освещаем истории, которые вдохновляют на действия и изменения. Узнайте, что стоит за событиями нашего времени!
    Подробная информация доступна по запросу – https://topic.lk/462

    回复

  22. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Подробнее можно узнать тут – https://vistoweekly.com/amazons-gpt55x

    回复

  23. В этой статье представлен занимательный и актуальный контент, который заставит вас задуматься. Мы обсуждаем насущные вопросы и проблемы, а также освещаем истории, которые вдохновляют на действия и изменения. Узнайте, что стоит за событиями нашего времени!
    Только для своих – https://bytorent.ru/kakoj-dolzhna-byt-idealnaya-mebel-dlya-kuhni

    回复

  24. Эта публикация дает возможность задействовать различные источники информации и представить их в удобной форме. Читатели смогут быстро найти нужные данные и получить ответы на интересующие их вопросы. Мы стремимся к четкости и доступности материала для всех!
    Неизвестные факты о… – https://expertschoicellc.com/how-high-quality-banqueting-linen-enhances-guest-experience-event-success

    回复

  25. Эта публикация завернет вас в вихрь увлекательного контента, сбрасывая стереотипы и открывая двери к новым идеям. Каждый абзац станет для вас открытием, полным ярких примеров и впечатляющих достижений. Подготовьтесь быть вовлеченными и удивленными каждый раз, когда продолжите читать.
    Что ещё нужно знать? – https://pietroconti.de/figur-im-raum/figur-im-raum_pietroconti_303_2017

    回复

  26. Эта публикация завернет вас в вихрь увлекательного контента, сбрасывая стереотипы и открывая двери к новым идеям. Каждый абзац станет для вас открытием, полным ярких примеров и впечатляющих достижений. Подготовьтесь быть вовлеченными и удивленными каждый раз, когда продолжите читать.
    Узнай первым! – http://mandggardens.com/2015/09/30/leap-into-electronic-typesetting

    回复

  27. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Получить больше информации – https://olalaboutique.com/5-bonnes-raisons-de-choisir-les-veilleuses-olalaboutique

    回复

  28. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Подробнее – https://sites.ac-nancy-metz.fr/histoire-geographie/2018/05/02/nouvelles-questions-aux-programmes-capes-agregation/concours-2

    回复

  29. Публикация приглашает вас исследовать неизведанное — от древних тайн до современных достижений науки. Вы узнаете, как случайные находки превращались в революции, а смелые мысли — в новые эры человеческого прогресса.
    Нажмите, чтобы узнать больше – https://excellentservices.com.au/5-best-things-to-remember-when-hiring-upholstery-cleaning-services

    回复

  30. Этот текст сочетает в себе элементы познавательного рассказа и аналитической подачи информации. Читатель получает доступ к уникальным данным, которые соединяют прошлое с настоящим и открывают двери в будущее.
    Открыть полностью – https://eyeblogs.com/vinesh-phogat-resigns-from-indian-railways

    回复

  31. Этот текст призван помочь читателю расширить кругозор и получить практические знания. Мы используем простой язык, наглядные примеры и структурированное изложение, чтобы сделать обучение максимально эффективным и увлекательным.
    Ознакомьтесь с аналитикой – https://www.medicalklinik.se/product/bass-ultra-x-203-head-phone

    回复

  32. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Погрузиться в научную дискуссию – https://daisycounselling.com.au/image-2

    回复

  33. Эта статья для ознакомления предлагает читателям общее представление об актуальной теме. Мы стремимся представить ключевые факты и идеи, которые помогут читателям получить представление о предмете и решить, стоит ли углубляться в изучение.
    Ознакомьтесь с аналитикой – https://178evakuator178.ru/?paged=15&cat=1

    回复

  34. Мы предлагаем вам подробное руководство, основанное на проверенных источниках и реальных примерах. Каждая часть публикации направлена на то, чтобы помочь вам разобраться в сложных вопросах и применить знания на практике.
    Ознакомиться с полной информацией – https://infinitebatteries.co.uk/hello-world

    回复

  35. Эта статья предлагает живое освещение актуальной темы с множеством интересных фактов. Мы рассмотрим ключевые моменты, которые делают данную тему важной и актуальной. Подготовьтесь к насыщенному путешествию по неизвестным аспектам и узнайте больше о значимых событиях.
    Получить полную информацию – https://f5fashion.vn/huong-dan-duong-di-den-dong-batu-kuala-lumpur-malaysia

    回复

  36. Эта статья предлагает живое освещение актуальной темы с множеством интересных фактов. Мы рассмотрим ключевые моменты, которые делают данную тему важной и актуальной. Подготовьтесь к насыщенному путешествию по неизвестным аспектам и узнайте больше о значимых событиях.
    Продолжить изучение – https://www.pattanshetti.in/kharab-land-and-its-treatment-in-karnataka

    回复

  37. Эта информационная статья содержит полезные факты, советы и рекомендации, которые помогут вам быть в курсе последних тенденций и изменений в выбранной области. Материал составлен так, чтобы быть полезным и понятным каждому.
    Секреты успеха внутри – https://www.varbite.techinvest.bg/praesent-et-urna-turpis-sadips

    回复

  38. В этом обзорном материале представлены увлекательные детали, которые находят отражение в различных аспектах жизни. Мы исследуем непонятные и интересные моменты, позволяя читателю увидеть картину целиком. Погрузитесь в мир знаний и удивительных открытий!
    Не пропусти важное – https://gb-sk.de/rasenpflege

    回复

  39. Эта информационная заметка содержит увлекательные сведения, которые могут вас удивить! Мы собрали интересные факты, которые сделают вашу жизнь ярче и полнее. Узнайте нечто новое о привычных аспектах повседневности и откройте для себя удивительный мир информации.
    Обратитесь за информацией – https://sabahi-sabahi.com/2021/01/05/%E2%98%86%E9%BB%92%E8%B1%86%E2%98%86

    回复

  40. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Более того — здесь – https://valesie.com/baby-boy-capsule-lookbook-has-just-arrived-to-miini

    回复

  41. Эта информационная заметка содержит увлекательные сведения, которые могут вас удивить! Мы собрали интересные факты, которые сделают вашу жизнь ярче и полнее. Узнайте нечто новое о привычных аспектах повседневности и откройте для себя удивительный мир информации.
    Изучить аспект более тщательно – https://joyeriasvanessa.com/product/medalla-de-filigrana-de-guadalupe

    回复

  42. Эта информационная статья содержит полезные факты, советы и рекомендации, которые помогут вам быть в курсе последних тенденций и изменений в выбранной области. Материал составлен так, чтобы быть полезным и понятным каждому.
    Более того — здесь – https://f5fashion.vn/tong-hop-hon-57-ve-qua-sinh-nhat-ff

    回复

  43. В этой статье вы найдете познавательную и занимательную информацию, которая поможет вам лучше понять мир вокруг. Мы собрали интересные данные, которые вдохновляют на размышления и побуждают к действиям. Открывайте новую информацию и получайте удовольствие от чтения!
    Посмотреть подробности – https://buyhghanabolics.com/what-is-post-cycle-therapy-pct

    回复

  44. Этот информационный материал собраны данные, которые помогут лучше понять текущие тенденции и процессы в различных сферах жизни. Мы предоставляем четкий анализ, графики и примеры, чтобы информация была не только понятной, но и практичной для принятия решений.
    Не пропусти важное – https://pcfmarseille15.fr/cropped-site_fede-1-png

    回复

  45. Эта информационная заметка содержит увлекательные сведения, которые могут вас удивить! Мы собрали интересные факты, которые сделают вашу жизнь ярче и полнее. Узнайте нечто новое о привычных аспектах повседневности и откройте для себя удивительный мир информации.
    Все материалы собраны здесь – https://new.arestipower.gr/sun-power-vl-opzs-series-280-4700-ah

    回复

  46. В статье представлены ключевые моменты по актуальной теме, дополненные советами экспертов и ссылками на дополнительные ресурсы. Цель материала — дать читателю инструменты для самостоятельного развития и принятия осознанных решений.
    Секреты успеха внутри – https://walkthetalk.be/uncategorized/hello-world

    回复

  47. В этой информационной статье вы найдете интересное содержание, которое поможет вам расширить свои знания. Мы предлагаем увлекательный подход и уникальные взгляды на обсуждаемые темы, побуждая пользователей к активному мышлению и критическому анализу.
    Детальнее – https://maidentistry.com/veneers-in-st-petersburg-fl/what-are-dental-veneers-cost-types-and-process

    回复

  48. В статье представлены ключевые моменты по актуальной теме, дополненные советами экспертов и ссылками на дополнительные ресурсы. Цель материала — дать читателю инструменты для самостоятельного развития и принятия осознанных решений.
    Узнать из первых рук – https://f5fashion.vn/chi-tiet-hon-53-ve-powerpoint-sinh-nhat-free

    回复

  49. Эта статья предлагает захватывающий и полезный контент, который привлечет внимание широкого круга читателей. Мы постараемся представить тебе идеи, которые вдохновят вас на изменения в жизни и предоставят практические решения для повседневных вопросов. Читайте и вдохновляйтесь!
    Изучить вопрос глубже – https://impac2.com.ar/interior-of-modern-living-room-with-armchair-and-f-3bcmvej-scaled-e1594732170557-jpg

    回复

  50. Эта статья сочетает в себе как полезные, так и интересные сведения, которые обогатят ваше понимание насущных тем. Мы предлагаем практические советы и рекомендации, которые легко внедрить в повседневную жизнь. Узнайте, как улучшить свои навыки и обогатить свой опыт с помощью простых, но эффективных решений.
    Углубиться в тему – https://vyvod-iz-zapoya-1.ru/

    回复

  51. Why people still use to read news papers when in this technological globe everything is existing on net?

    回复

  52. I think the admin of this website is in fact working hard in favor of his website, since here every stuff is quality based material.

    回复

  53. wonderful post, very informative. I wonder why the opposite specialists of this sector don’t realize this. You should proceed your writing. I’m sure, you’ve a huge readers’ base already!

    回复

  55. Your style is so unique compared to other folks I have read stuff from. I appreciate you for posting when you’ve got the opportunity, Guess I’ll just bookmark this blog.

    [url=https://skyphonez.com.au/dafabet-app-%e0%b8%94%e0%b8%b2%e0%b8%a7%e0%b8%99%e0%b9%8c%e0%b9%82%e0%b8%ab%e0%b8%a5%e0%b8%94%e0%b9%81%e0%b8%ad%e0%b8%9b%e0%b9%80%e0%b8%9e%e0%b8%b7%e0%b9%88%e0%b8%ad%e0%b8%81%e0%b8%b2%e0%b8%a3/]skyphonez.com.au[/url]

    回复

  73. “And you did it with that. Your boner?” His dad asks. “I guess.”

    回复

  82. “That is your cock, son.” His father, says. “…but it does not make you a man. It only makes you a boy with a hard cock in his hand.” He runs the towel through his curl-filled hair, and down over his chest, where the early signs of his manhood sprout like an uneven crop of hairs across his chest that run down to his furry-pillowed crotch. Where the throbbing from his hard-on springs back as the damp towel whips his erection back and forth with each swipe of the now dampened towel.

    回复

  83. He does not answer but tilts his head down in an almost subservient nature to his father. “I’m am nearly 6 foot 2 inches tall, dad. I weigh 210 lbs. I think, dad. At least I was the last time we were weighed at football practice.” The son says. “Much bigger than you, I should say.”

    回复

  84. “And you did it with that. Your boner?” His dad asks. “I guess.” He does not say anything in response to his father as his cock continues pulsing and jumping as the blood engorges his youthful cock more. And more.

    回复

  85. I used my teeth to strip off daddy’s black sheer socks. I placed them in my mouth and washed them with my saliva. I swallowed every single sweat and stink from these socks. It takes so well. I rolled them into a ball and stuck them into my jockstrap where my small dick and balls were. sex porn mom Daddy smiled and said, “ that is my good boy. Don’t even want to leave your daddy’s Ripe socks on the floor. That’s the respect I love boy.” I then was told to clean his left foot. “Scrub these whitish paste out in my toenails. I want you to smell and place them in your mouth and let me see.” Daddy commented. It smelled and tasted like Brie cheese. Then I moved my tongue in between daddy’s toes. I cleaned up so well. Just thought I was finished. Daddy said,” the sole is clammy. It has nature feet oil after a whole day in the shoes, you think you finished fag. Keep working on that.”

    回复

  91. This is nicely put. .
    buy online casino script [url=https://usacasinomaster.com/#]online casino games free[/url] the best online slots casino

    回复

  106. Helpful data. Many thanks!
    new casinos online no deposit bonus [url=https://luckyusaplay.com/#]no deposit online casino bonus[/url] online casino games 888

    回复

  114. You mentioned that effectively.
    agen oriental casino online [url=https://usacasinomaster.com/#]online casino usa no deposit bonus[/url] online spiele casino

    回复

  116. Nicely put. Kudos.
    nj online casino reviews [url=https://luckyusaplay.com/#]online casino usa[/url] online casino strategy

    回复

  120. You suggested that adequately!
    atlantis casino reservation confirmation online [url=https://luckyusaplay.com/#]online casino free spins[/url] agen taruhan casino ibcbet online

    回复
联系我们

联系我们

(44)07934433023

在线咨询: QQ交谈

邮箱: info@bioengx.org

关注微信
微信扫一扫关注我们

微信扫一扫关注我们

关注微博
返回顶部