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明胶酶谱101

酶谱(zymography)是一项通过底物降解来分析蛋白酶活性的技术。明胶酶谱法被广泛地用于明胶酶A(MMP-2)和明胶酶B(MMP-9)的测定。其基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE,含0.1%明胶)电泳分离,然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性,在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶,最后用考马斯亮蓝将凝胶染色,再脱色,在蓝色背景下可出现白色条带,条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。

我们知道SDS-PAGE是变性凝胶电泳,明胶酶MMPs是如何恢复活性的呢?其原理是这样的在电泳过程中,SDS与样品中的MMPs进行可逆结合,破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用,而只有当将胶置Trition中洗脱时,由于SDS被Trition结合而去除,从而使MMPs恢复了活性。小编今儿给大家详细介绍一下明胶酶谱中所需溶液的配方以及实验操作方法。

明胶酶谱溶液配制

11×洗脱液(zymogram renaturing buffer):Triton X-100,5%(v/v)in water

  • 量取Triton X-100 25ml,加去离子水定容至1000 ml。

 

21×孵育液(zymogram development buffer):50 mM Tris-HCl,5 mM CaCl22H2O,0.02% Brij-35,0.2 M NaCl,pH7.6 。

  • 称取Tris碱06 g,CaCl2·2H2O 0.74 g(或CaCl0.555 g),Brij-35 (Tricosaethylene glycol mono-n-dodecyl ether) 0.2 g,NaCl 11.7 g;

  • 加水至800 ml;

  • 用浓HCl调pH至6;

  • 定容至1000 ml。

 

32×上样缓冲液(不含β巯基乙(β-Mercaptoethanol))

0.5 M Tris-HCl,pH 6.8 2.5 ml
甘油 (glycerol) 2.0 ml
10%(w/v)SDS 4.0 ml
0.1% 溴酚蓝 (Bromophenol blue) 0.5 ml
dH2O 1 ml
Total 10 ml

 

45%(w/v)考马斯亮蓝R-250 400 ml

  • 称取2 g考马斯亮蓝R-250,置于1 L烧杯中;

  • 量取100 ml异丙醇 (isopropanol) 加入上述烧杯中,搅拌溶解;

  • 加入40 ml冰醋酸 (acetic acid),搅拌均匀;

  • 加入260 ml去离子水,搅拌溶解;

  • 用滤纸过滤除去颗粒物质后,室温保存。

 

5考马斯亮蓝脱色液(400ml)

甲醇:乙酸:水=200ml: 40ml: 160ml =5:1:4 。

 

6明胶储液(10 mg/ml in water)

  • 称取明胶(Sigma,猪皮来源)1 g,加去离子水10 ml后溶解;

  • 配好后储存于4℃。若凝固成胶冻状可用55℃水浴解冻。

 

710% SDS-PAGE凝胶-分离胶(含0 mg/ml 明胶)

dH2O 3ml
30%丙烯酰胺溶液 (acrylamide solution) 3.3 ml
1.5 M Tris-HCl (pH 8.8) 2.5 ml
10% SDS 0.1 ml
10%过硫酸铵 (Ammonium persulfate) 0.1 ml
TEMED 0.004 ml
10 mg/ml明胶 1 ml
Total 10 ml

 

明胶酶谱操作步骤

  1. 按照自己蛋白酶的大小准备相应浓度的胶。记得在分离胶里面加入明胶储液,调成最后浓度为1% (1 mg/ml) 的胶。

  2. 把一份蛋白样品和一份2倍的上样缓冲液混合。千万不要加热,在室温中放置10分钟即可。

  3. 按常规操作点样,并且跑胶。跑胶的时间和电压取决于胶的浓度、电泳缓冲液的浓度和pH值。

  4. 跑完胶之后,把胶放在洗脱液中室温摇动孵育30分钟。一般来说两个mini gel用100ml就足够了。

  5. 把洗脱液倒掉之后,换上孵育液室温摇动孵育30分钟。换新的孵育液之后,至少在37度下再孵育一个小时。如果能过夜孵育的话,敏感度会有所提高。大家可以实验性的来调节孵育时间来找到最适合自己的条件。

  6. 用考马斯亮蓝R-250染色30分钟。这里需要提醒一下,最好用5 % (w/v) 的溶液来代替常用的0.1 % (w/v) 来增加对比度。使用考马斯亮蓝脱色液脱色之后,就可以观察蛋白酶的活性了。有活性的地方,就会看到白色透明的条带,因为明胶底物被分解掉了,背景则是深蓝色。

 

References

1. http://baike.baidu.com/view/8414043.htm

2. Liota, L.A. and W.G. Stetler-Stevenson (1990) Cancer Biology, 1, 96-106

3. http://www.millipore.com/techpublications/tech1/mcproto009

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作者: fiofiona

伦敦大学学院博士,研究方向VLP生产,微藻的基因工程



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