基于遗传密码子扩展技术研究蛋白-蛋白相互作用

蛋白-蛋白相互作用在生命活动中扮演十分重要的角色，研究蛋白-蛋白相互作用将有助于阐明特定生命过程及为相关疾病的治疗提供理论基础。传统生物化学方法研究蛋白-蛋白相互作用存在分辨率低、假阳性高等缺点。近年来，基于遗传密码子扩展技术发展非天然氨基酸解析蛋白-蛋白相互作用已成为强有力的化学生物学工具。目前已发展光交联(photo-crosslink UAA)和化学交联(Bioactive UAA)两种类型的非天然氨基酸用于研究蛋白-蛋白相互作用。

蛋白-蛋白相互作用(Protein-Protein Interactions, PPIs)在生命活动中扮演十分重要的角色，研究PPI将有助于阐明特定生命过程及相关疾病的治疗提供理论基础。传统生物化学方法研究PPI主要包括免疫沉淀、串联亲和纯化以及酵母双杂交等，然而上述方法存在分辨率低、假阳性高等缺点。研究PPI的难点在于实时捕获native状态下的瞬时非共价PPI，特别是在某些极端条件下(如极端pH条件)。近年来，共价交联技术已成为研究蛋白-蛋白相互作用的重要手段。

在共价交联策略中，基于遗传密码子扩展技术研究蛋白-蛋白相互作用已成为强有力的化学生物学工具。遗传密码子扩展技术是由Peter G. Schultz为代表的研究人员开发的化学生物学技术，该技术可在蛋白的特异位点引入非天然氨基酸(UAA)。具体来说，该技术通过系统性的筛选可得到具有生物正交性的氨酰tRNA-氨酰tRNA合成酶系统，该系统在不影响20种天然氨基酸编码的同时，可利用TAG密码子在特异位点引入非天然氨基酸。随着遗传密码子扩展技术的不断发展，目前已有上百种非天然氨基酸被成功引入到蛋白的特异位点，所引入的非天然氨基酸的结构和功能也越来越多样化。因此，基于遗传密码子扩展技术发展共价交联型非天然氨基酸研究蛋白-蛋白相互作用便应运而生。

目前基于遗传密码子扩展研究蛋白-蛋白相互作用的策略主要是将native状态下的非共价蛋白-蛋白相互作用转化为共价的相互作用，再通过特异性的富集对靶蛋白复合物进行成像表征和蛋白质组学分析，从而实现解析蛋白-蛋白相互作用。因此引入的UAA应具备两个功能：一是捕获瞬时非共价PPI，将其转化为共价作用；二是解析蛋白-蛋白相互作用情况。目前已发展的UAA用于捕获蛋白-蛋白相互作用主要包括光诱导和化学诱导两种[1]。

第一类光交联UAA探针主要是通过在靶蛋白的特异位点引入带有光交联基团的UAA；其中的光交联基团可在特定波长激发下产生自由基从而与其位置邻近的氨基酸残基发生化学反应生成共价化学键，从而将蛋白蛋白的非共价作用转化为共价作用，再进一步利用蛋白质组学技术可解析出蛋白-蛋白相互作用情况。目前已发展的光交联基团主要包括arylazide, benzophenone, diazirine等几类(图1)，其中aryl azide和diazirine在交联效率和背景信号等方面均优于benzophenone。

图1源自文献[2]

图2源自文献[1]

因此，基于上述光交联基团，科研人员发展了一系列光交联UAA用于探究蛋白-蛋白相互作用(图2)。此外，近年来科研人员还进一步发展了多功能型光交联UAA，与早期的光交联UAA相比，多功能型光交联UAA除了能捕获瞬时非共价蛋白-蛋白相互作用外，还带有“亲和标签”用于扣除非特异或背景蛋白，例如引入炔基作为“亲和标签”用于研究蛋白-蛋白相互作用，当光照条件下形成蛋白-蛋白复合物后，通过点击化学反应可实现蛋白-蛋白复合物的特异性富集，“过滤”非特异蛋白或背景蛋白，再通过定量蛋白质组学技术可解析蛋白-蛋白相互作用情况。

其中，值得指出的是，北京大学陈鹏课题组在基于遗传密码子扩展技术研究蛋白-蛋白相互作用方面做出了系统性的工作。早期陈鹏课题组发展了DiZPK光交联UAA探针，为了进一步提高光交联捕获效率、质谱鉴定效率，他们将Se元素引入发展了系列多功能光交联UAA探针(图3和图4)。例如，当Se处于γ位时得到探针DiZSeK，DiZSeK完成光交联后可被氧化切除，得到含硒酸Prey蛋白，含硒酸Prey蛋白进一步与含炔苯胺反应得到含炔产物，该产物即可进行click反应用于目标蛋白的富集、质谱鉴定。而当Se处于δ位时得到探针DiZHSeC，与探针DiZSeK不同的是，探针DiZHSeC被氧化切除后得到含丙烯酰胺基团的骨架N-(4,4-bis-substituted-pentyl) acrylamide (NPAA)，NPAA结构可做质谱标签用于靶蛋白的质谱鉴定；此外氧化切除产生的丙烯酰胺基团与四唑类化合物进行photo-click反应可用于靶蛋白的标记。他们还在最新一代探针DiZASeC中引入炔基，探针DiZASeC除了具有DiZHSeC的优点外，引入的炔基可进行点击化学反应从而更有利于降低背景信号、捕获低丰度靶蛋白[3]。

图3源自文献[3]

图4源自文献[4]

第二类是化学交联UAA探针。与光交联相比，化学交联UAA(Bioactive UAA)探针具有一定的反应活性。即Bioactive UAA在生理条件下处于稳定状态，而在一定条件下可与特定的氨基酸残基发生反应。常见的Bioactive UAA含活性较低的亲电Warhead，该类型亲电Warhead不会与生物体系内游离的亲核基团(如巯基、氨基等)发生反应，通过遗传密码子扩展技术将Bioactive UAA引入到蛋白的特异位点后，由于邻近效应的作用使反应基团局部浓度陡增，进而使其与邻近位置的亲核性氨基酸侧链(如巯基、氨基)发生共价反应；基于上述策略可使蛋白-蛋白的非共价作用转化为共价作用，进而捕获蛋白-蛋白相互作用。显而易见，当引入的亲电性Warhead过于活泼时会发生副反应，即与生物体系内游离的亲核性基团发生反应，而非邻近效应促进的共价反应，因此该类型UAA探针的设计关键在于平衡Warhead的反应性和选择性。近年来随着研究的不断深入，科研人员已经发展了多种Bioactive UAA类型探针(图5)。

图5源自文献[1]

2013年，Salk研究所王磊课题组(现在UCSF)首次报道了Bioactive UAA类型探针[5]。UAA 14在生理条件下处于稳定状态，而当与半胱氨酸Cys处于邻近位置时，由于局部浓度增高进而可发生亲核加成反应形成稳定的硫醚键；上述UAA 14探针已成功用于探究CRF1R与配体的相互作用。受到上述开创性工作的启发，一系列Bioactive UAA便应运而生。目前已发展的Bioactive UAA不在局限于与Cys反应，还发展了赖氨酸、组氨酸依赖型Bioactive UAA。最近，来自北京大学药学院的刘涛课题组运用Bioactive UAA类型探针探究了蛋白酪氨酸磷酸酶及其与底物相互作用情况[6]。

总的来说，基于遗传密码子扩展技术发展非天然氨基酸已成功用于蛋白-蛋白相互作用的研究；目前所利用的非天然氨基酸主要包括光交联和化学交联两种。两种非天然氨基酸均可通过遗传密码子扩展技术实现在蛋白的特异位点引入，其中的光交联UAA探针在特定波长激发下可将蛋白-蛋白非共价作用转化为共价作用，进而捕获到蛋白-蛋白复合物；化学交联UAA(Bioactive UAA)则是通过邻近效应介导发生共价反应，从而得到蛋白-蛋白复合物。与传统方法相比，基于遗传密码子扩展技术有利于研究native状态下蛋白-蛋白的瞬时相互作用、极端条件下的蛋白-蛋白相互作用、低分度蛋白的相互作用以及弱蛋白-蛋白相互作用等。

[1] Nguyen, T. A.; Cigler, M.; Lang, K. Expanding the Genetic Code to Study Protein-Protein Interactions. Angew. Chem. Int. Edit. 2018, 57, 14350-14361.

[2] Peng, T.; Yuan, X. Q.; Hang, H. C. Turning the spotlight on protein-lipid interactions in cells. Curr. Opin. Chem. Biol. 2014, 21, 144-153.

[3] He, D.; Xie, X.; Yang, F.; Zhang, H.; Su, H.; Ge, Y.; Song, H.; Chen, P. R. Quantitative and Comparative Profiling of Protease Substrates through a Genetically Encoded Multifunctional Photocrosslinker. Angew. Chem. Int. Edit. 2017, 56, 14521-14525.

[4] Zhang, S.; He, D.; Lin, Z.; Yang, Y.; Song, H.; Chen, P. R. Conditional Chaperone-Client Interactions Revealed by Genetically Encoded Photo-cross-linkers. Acc. Chem. Res. 2017, 50, 1184−1192.

[5] Xiang, Z.; Ren, H.; Hu, Y. S.; Coin, I.; Wei, J.; Cang, H.; Wang, L. Adding an unnatural covalent bond to proteins through proximity-enhanced bioreactivity. Nat. Methods 2013, 10 , 885-888.

[6] Tang, H.; Dai, Z.; Qin, X.; Cai, W.; Hu, L.; Huang, Y.; Cao, W.; Yang, F.; Wang, C.; Liu, T. Proteomic Identification of Protein Tyrosine Phosphatase and Substrate Interactions in Living Mammalian Cells by Genetic Encoding of Irreversible Enzyme Inhibitors. J. Am. Chem. Soc. 2018, 140, 13253-13259.