您的位置 首页 生物催化剂

ACS Catal. | 深度序列−功能表征揭示增强酶活性的多种途径

作者: 刘克（liuke） 发布: 2022-06-19 39阅读 223评论

2022年2月，塔夫茨大学化学与生物工程系的NikhilU. Nair教授团队在ACS Catalysis上发表了题为“In-Depth Sequence−Function Characterization Reveals Multiple Pathways to Enhance Enzymatic Activity”的文章。

深度突变扫描 (Deep mutational scanning, DMS)已成为评估序列-功能关系、识别功能热点、并加速和/或扩大工程活动的强大方法。它可以提供全面的序列-功能关系图以探索蛋白质适应度景观、发现新的功能相关位点以及确定蛋白质工程的有益突变组合。本文作者开发了一种工作流程来设计苯丙氨酸解氨酶(PAL)，并进一步评估特定突变如何克服催化过程中限制活性的不同步骤，整体流程如图1所示。

图1  工作流程

苯丙氨酸解氨酶(PAL)可将L-苯丙氨酸(Phe)脱氨基生成反式肉桂酸(tCA)和铵 (NH4+)，含有4-亚甲基咪唑-5-一(MIO)加合物。PAL可用于天然产物和精细化学品的合成以及苯丙酮尿症的治疗。虽然有大量关于PAL的结构和催化机制的文献解释了底物结合口袋中的残基如何促进底物特异性和转换数，但是对如何通过突变不与底物直接接触的残基来提高酶催化性能的了解很少。

该团队此前开发了一种生长偶联富集技术，用于在大肠杆菌中快速筛选AvPAL的高活性变体。原理是高活性AvPAL变体可以更快地催化Phe脱氨生成NH4+，从而促进大肠杆菌的生长。基于此技术，作者对AvPAL进行随机突变获得了Naive文库，并传代富集了3次。然后使用高通量筛选方法对AvPAL进行DMS，获得其详细序列-功能图谱（图2）。在第3代的突变体文库中，218、222和453位点的突变高度富集（图2a）。Naive文库每个基因包含大约2-4个氨基酸突变，突变分布广泛（565个残基），每个残基平均有5.6个替换。而第3代中只有222个位置有突变，且平均只有0.6个突变（图2b）。负适应度（灰色）指的是在传代过程中出现频率下降的突变，而适应度最高的“热点”T102、G218、M222L、I268、D306、G360、N453被用于后续研究（图2c）。通过对比，作者发现适应度得分与酶的催化活性具有很高的相关性。

图2  AvPAL的DMS结果

作者计算了3个传代突变库相对于Naive库的适应度梯度，并将适应度映射到AvPAL蛋白结构上（图3）。AvPAL是同源四聚体，包含四个活性位点，每个活性位点由来自三个不同单体和一个MIO基团的残基组成。多数有益突变距离同一链的活性中心较远而靠近邻近链的活性中心。有趣的是，前四个突变(G218S/A、M222L和N453S)作为单位点突变的丰度最高，而三点组合突变则完全不存在，这表明有必要进一步组合研究这些热点。

图3  识别和定位最合适的位点

作者利用7个热点分别构建了包含一个（7C1  7选1），三个（7C3  7选3），七个（7C7  7选7）位点突变的组合突变库。7C1文库中所有位点都有比野生型更适合的替换（图 4a），而7C3和7C7文库中较少的突变具有积极的适应度得分（图 4b 和 c）。这表明虽然许多突变单独有助于提高适应度，但大多数突变并不协同作用。对与AvPAL同源性最高的100个蛋白质进行序列比较，发现对于218、222、306和360位点，天然序列中完全涵盖了研究中发现的最适合的变体。而对于102、268和453位点，发现了仅通过序列比对无法预测的新突变(图4d)。其中，T102E-M222L和T102R-M222L-D306G的kcat分别显示出2.4倍和2.25倍的改进。

图4  饱和突变库的表征

为了揭示酶活增加的机制，作者对各突变体进行MD模拟分析。在MD模拟期间底物和催化残基之间的紧密接近表明稳定的E-S复合物和近攻击构象的形成。通过测量变体的底物氨基氮(Phe(N))与MIO亚甲基碳(MIO(Cβ2))和相邻链上314位酪氨酸羟基氧(Y314(O))之间的距离，以及对比蛋白质主链原子的均方根波动(RMSF)，发现对于五种高活性变体中的四种（M222L、G218S、T012E-M222L和T102R-M222L-D306G），底物更容易接近催化位点形成稳定的近攻击构象（图5）。然而，N453S与亲本相比基本没有变化，这表明其作用方式可能不涉及直接调节底物和催化残基之间的相互作用。

图5  MD结果分析

由于N453S位于活性位点外围，作者认为它可能会影响底物Phe的结合过程。因此，对AvPAL和突变体进行导向分子动力学(SMD)以研究Phe从活性位点离开蛋白质期间的能量变化与涉及到的相关残基。平均力势（PMF）图显示N453S有两个最小值，而在AvPAL中没有观察到（图6a）。从伞形采样中提取Phe的构象变化，并映射到AvPAL和N453S的结构上（图 6b和c）。对于AvPAL，通向活性位点的路径很窄，导致进入受限且在能量上不利。N453S的路径更宽，能量更有利，底物呈现良好的构象。

图6 AvPAL、N453S的SMD和伞形采样结果

接着作者假设N453S与其他突变体结合可能会进一步提高酶活性，并构建了M222L、L4P-G218S、T102E-M222L和T102R-M222L-D306G的N453S突变体。通过评估纯酶的动力学（图7a-e）和Phe到tCA的全细胞转化（图7f），发现添加N453S的变体都显示出与亲本相似的动力学参数，且vmax都有所降低，但T102E-M222L-N453S对Phe的转化率却提高了6倍以上。作者假设Phe可能更容易从活性位点取代 tCA从而减少了产物抑制，并随后通过添加产物的方式验证了该假设。

图7  N453S的动力学表征和全细胞活性

基于此前对PAL反应机制的研究，作者通过QM/MM模拟提出了AvPAL的反应机理（图8a-c），并计算出了总相对自由能图（图8d）。对比TS1和IS1的能量可以看出L108G < AvPAL< M222L < G218S<T102EM222L < T102R-M222L-D306G，符合实验结果。

图8  对AvPAL的QM/MM研究

总之，作者报告了DMS可以指导进一步的蛋白质工程，同时也为阐明催化循环局限性的基础研究提供了起点。对含有MIO的酶AvPAL提供了最广泛的序列功能分析，并创建高活性的变体。通过计算研究（QM/MM、MD 和SMD+QM/MM），揭示了突变增强酶活性的机制，并获得更优良的突变体（T102R-M222L-N453S)。这不仅显著推进了PAL的酶学和工程学，而且还展示了使用DMS指导基础和应用酶学的能力。

 

论文链接：

https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscatal.1c05508?fig=fig1&ref=pdf

555赞
标签:

作者: 刘克（liuke）



相关文章

发表回复

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注

评论列表(223)

  155. [b]Здравствуйте[/b]!
    Задался вопросом: можно ли на самом деле купить диплом государственного образца в Москве? Был приятно удивлен — это реально и легально!
    Сначала искал информацию в интернете на тему: купить диплом моряка, купить диплом слесаря, купить диплом в петрозаводске, купить диплом в ярославле, купить диплом в воткинске и получил базовые знания. В итоге остановился на материале: http://lapartdieu.ch/hello-world/?unapproved=993230&moderation-hash=38b807b0b70cc82dcec756338b7be2a0#comment-993230
    Хорошей учебы!

    回复

  167. 娛樂城
    網上娛樂城的天地

    隨著互聯網的迅速發展，在線娛樂城（線上賭場）已經成為許多人消遣的新選擇。網上娛樂城不僅提供多樣化的遊戲選擇，還能讓玩家在家中就能體驗到賭場的樂趣和快感。本文將研究線上娛樂城的特徵、好處以及一些常見的的游戲。

    什麼線上娛樂城？
    在線娛樂城是一種通過互聯網提供博彩遊戲的平台。玩家可以通過電腦設備、智能手機或平板電腦進入這些網站，參與各種賭錢活動，如撲克、輪盤賭、21點和老虎機等。這些平台通常由專業的的軟體公司開發，確保游戲的公正和安全。

    網上娛樂城的好處
    便利：玩家無需離開家，就能享受賭博的快感。這對於那些住在在偏遠實體賭場地區的人來說特別方便。

    多元化的遊戲選擇：在線娛樂城通常提供比實體賭場更多的遊戲選擇，並且經常升級游戲內容，保持新鮮感。

    優惠和獎金：許多在線娛樂城提供多樣的獎金計劃，包括註冊獎金、存款紅利和會員計劃，吸引新新玩家並鼓勵老玩家繼續遊戲。

    穩定性和隱私：正當的網上娛樂城使用先進的的加密技術來保護玩家的私人信息和金融交易，確保游戲過程的穩定和公正。

    常見的的在線娛樂城遊戲
    德州撲克：撲克是最受歡迎的賭錢游戲之一。網上娛樂城提供各種德州撲克變體，如德州扑克、奧馬哈和七張牌撲克等。

    輪盤：輪盤是一種傳統的賭場遊戲，玩家可以下注在數字、數字組合或顏色上，然後看轉球落在哪個區域。

    黑傑克：又稱為黑傑克，這是一種對比玩家和莊家點數的游戲，目標是讓手牌點數點數儘量接近21點但不超過。

    吃角子老虎：老虎機是最容易也是最常見的賭博遊戲之一，玩家只需旋轉捲軸，等待圖案排列出贏得的組合。

    總結
    在線娛樂城為現代的賭博愛好者提供了一個方便、刺激且多元化的娛樂方式。無論是撲克迷還是老虎機迷，大家都能在這些平台上找到適合自己的遊戲。同時，隨著科技的不斷進步，在線娛樂城的游戲體驗將變化越來越現實和吸引人。然而，玩家在享受遊戲的同時，也應該自律，避免沉溺於賭博活動，保持健康的遊戲心態。

    回复

  171. You actually make it seem really easy with your presentation however
    I to find this topic to be really one thing that
    I believe I’d by no means understand. It kind of feels too complex and
    extremely huge for me. I’m looking forward to your subsequent put
    up, I’ll try to get the cling of it!

    Feel free to visit my web blog nordvpn special coupon code 2024

    回复

  203. Hey I know this is off topic but I was wondering if you knew of any widgets I could add to my blog that automatically tweet my newest twitter updates.
    I’ve been looking for a plug-in like this for quite some time and was hoping maybe you
    would have some experience with something like this.

    Please let me know if you run into anything. I truly enjoy reading your blog and I look
    forward to your new updates.

    Feel free to surf to my website … vpn code 2024

    回复
联系我们

联系我们

(44)07934433023

在线咨询: QQ交谈

邮箱: info@bioengx.org

关注微信
微信扫一扫关注我们

微信扫一扫关注我们

关注微博
返回顶部