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Colony PCR, Nah~, Colony Cracking

在分子克隆的试验中,如何快速检测目标序列已成功插入到质粒一直是个值得讨论的问题。BioEngX以前提到过用colony PCR或是质粒测序的方式(colony PCR ,)检测阳性质粒(positive plasmid)。colony PCR原理很简单,就是直接使用菌落作为PCR母板,尝试反应扩增目标序列,如果有目标条带,则证明序列已成功插入。那么,还有没有比colony PCR还要快的检测方法?自然是有的—-colony cracking.

Colony cracking,小编愿意称它为菌落破裂法,原理简单,直接暴力,适合于快速检查大量菌落。把菌落直接裂解,将裂解液跑过琼脂胶,通过观察携带目标片段的质粒和普通质粒之间移动距离的差别,来判断对应菌落是否携带阳性质粒。显然如果插入片段越大,阳性质粒和普通质粒在移动距离上就会差别越大,也就越容易看出区别。

配置裂解液

1X裂解液组成成分

100mM NaOH, 60mM KCl, 5mM EDTA, 0.5% SDS

 

方法

  1. 菌落生长到直径2 mm左右(菌落太小会导致所含质粒的量不足,不易于显示于琼脂胶上)。
  2. 挖一半菌落,投于20 uL 裂解液中。
  3. 55°C 培养20 min。
  4. 置于冰上2 min。
  5. 最大速度离心 3 min。
  6. 裂解液加loading buffer后,进行电泳。

 

注意

  1. 检测质粒最好是高复制量的质粒,否则菌落携带质粒太少,跑胶后的质粒DNA信号和细胞基因组DNA信号无法区别。
  2. colony cracking不是一个能准确检测插入片段大小的方法,只能检测是否有片段插入到了质粒中。
  3. 当有大量菌落需要被检测,而且时间有限的时候,建议用colony cracking;如果只需检测一两个菌落,那么简单的colony PCR或是提取质粒送测序则更为实用。
  4. 细胞裂解后自身基因组DNA也会被释放出来,因此在琼脂胶中出现很多背景信号也是正常,有可能会影响观察。

 

Reference

Plasmid detection and sizing in single colony lysates. WM Barnes. Science 28 January 1977: Vol. 195. no. 4276, pp. 393 – 394.

 

你尝试过colony cracking这种方法吗?欢迎留言讨论~~

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作者: 卢阳

伦敦大学学院博士,研究方向为生物催化和细胞色素P450开发;BioEngX创始人之一。知乎主页:簏岩。



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