在分子克隆的试验中,如何快速检测目标序列已成功插入到质粒一直是个值得讨论的问题。BioEngX以前提到过用colony PCR或是质粒测序的方式(colony PCR ,戳)检测阳性质粒(positive plasmid)。colony PCR原理很简单,就是直接使用菌落作为PCR母板,尝试反应扩增目标序列,如果有目标条带,则证明序列已成功插入。那么,还有没有比colony PCR还要快的检测方法?自然是有的—-colony cracking.
Colony cracking,小编愿意称它为菌落破裂法,原理简单,直接暴力,适合于快速检查大量菌落。把菌落直接裂解,将裂解液跑过琼脂胶,通过观察携带目标片段的质粒和普通质粒之间移动距离的差别,来判断对应菌落是否携带阳性质粒。显然如果插入片段越大,阳性质粒和普通质粒在移动距离上就会差别越大,也就越容易看出区别。
配置裂解液
1X裂解液组成成分
100mM NaOH, 60mM KCl, 5mM EDTA, 0.5% SDS
方法
- 菌落生长到直径2 mm左右(菌落太小会导致所含质粒的量不足,不易于显示于琼脂胶上)。
- 挖一半菌落,投于20 uL 裂解液中。
- 55°C 培养20 min。
- 置于冰上2 min。
- 最大速度离心 3 min。
- 裂解液加loading buffer后,进行电泳。
注意
- 检测质粒最好是高复制量的质粒,否则菌落携带质粒太少,跑胶后的质粒DNA信号和细胞基因组DNA信号无法区别。
- colony cracking不是一个能准确检测插入片段大小的方法,只能检测是否有片段插入到了质粒中。
- 当有大量菌落需要被检测,而且时间有限的时候,建议用colony cracking;如果只需检测一两个菌落,那么简单的colony PCR或是提取质粒送测序则更为实用。
- 细胞裂解后自身基因组DNA也会被释放出来,因此在琼脂胶中出现很多背景信号也是正常,有可能会影响观察。
Reference
Plasmid detection and sizing in single colony lysates. WM Barnes. Science 28 January 1977: Vol. 195. no. 4276, pp. 393 – 394.
你尝试过colony cracking这种方法吗?欢迎留言讨论~~
图片和内容由BioEngX原创,欢迎留言讨论哦,如需转载,请联系管理员。
管理员邮箱:info@bioengx.org;管理员微信:bioengxadmin
扫描下方二维码关注BioEngX官方微信公众平台
metoprolol 100mg tablet – order cozaar 50mg pill adalat without prescription
microzide cost – order norvasc 10mg generic zebeta price
famvir 250mg oral – buy valaciclovir 500mg sale valcivir pills
order nizoral 200mg for sale – order ketoconazole pills buy generic sporanox
buy generic semaglutide 14mg – purchase glucovance online cheap purchase desmopressin generic
lamisil over the counter – grifulvin v oral cheap grifulvin v
brand micronase 5mg – order glucotrol 5mg pills pill forxiga 10 mg
cheap clarinex – flixotide order best antihistamine pills
albuterol online buy – seroflo buy online order theo-24 Cr for sale
fda ivermectin – oral aczone buy cefaclor online cheap
how to get azithromycin without a prescription – order ciprofloxacin 500mg for sale ciplox 500 mg canada
cheap amoxicillin – cephalexin 250mg cheap buy generic baycip
augmentin 1000mg cheap – buy cheap zyvox how to buy cipro
buy atarax 10mg for sale – purchase atarax amitriptyline 10mg pill
cheap quetiapine – cheap venlafaxine 75mg order eskalith for sale
clozaril online order – clozaril 100mg generic generic famotidine 40mg
buy zidovudine generic – generic avalide zyloprim 100mg us
glucophage 1000mg cost – buy lincomycin buy lincocin online cheap
buy lasix pills – candesartan 16mg oral buy capoten 25mg for sale
buy ampicillin pills for sale vibra-tabs sale amoxil uk
metronidazole 200mg pills – amoxil pills zithromax pills
buy ivermectin 3mg online – buy aczone online buy tetracycline generic
order valacyclovir – buy cheap generic valtrex order acyclovir 400mg sale
ciprofloxacin 500 mg without prescription – order erythromycin cost erythromycin
order metronidazole – purchase amoxil for sale buy azithromycin 250mg
cipro 1000mg brand – buy augmentin 375mg online augmentin 375mg cheap
generic ciprofloxacin 1000mg – order keflex 250mg pill augmentin oral
atorvastatin 80mg uk buy generic lipitor 20mg purchase lipitor online cheap