您的位置 首页 DNA/RNA技术

DNA 测序技术的发展：初代桑格法

发布: 2015-11-04 8,638阅读 246评论

从1977年第一代DNA测序技术（桑格法），发展至今将近四十年时间，测序技术已取得了相当大的发展。虽然就当前形势看来，第二代短读长测序技术在全球测序市场上仍然占有着绝对的优势位置，但第三测序技术也在逐步成熟之中。测序技术的每一次变革，都对基因组研究，疾病研究，药物研发等领域产生巨大的推动作用。小编在本文就简单介绍一下DNA测序的发展流程和初代桑格测序的原理。在下期的文章中，小编会再聊聊第二代和第三代测序技术。

 测序技术发展史

自从确定了DNA是遗传物质以后，人类就没有停止过对DNA的探索。继上世纪五十年代确定DNA双螺旋结构后，二十世纪七十年代，桑格（Sanger）和考尔森（Coulson）开创了双脱氧链终止法用于DNA测序。值得注意的是，桑格法的发明其实是早于PCR技术的（图1）。

YL01
图1：DNA测序技术发展历史。图中显灰色的部分为初代桑格法测序技术的发展成就。粉色条框为第二代测序技术的成就。橙色部分则是第三代测序的成就。

由于测序技术的迅速发展，测序成本逐年降低，也导致各种大型商业化的测序中心的成立。如图2，世界上主流测序平台的分布图。值得骄傲的是，中国的测序业的发展并不逊色于欧洲各国，美国还是聚集了世界上最多的测序中心。

YL02

图2：测序平台在世界各地的分布情况。数字代表测序中心的数量。该地区超过百个测序中心，定位圆圈则会显示为红色。数据来源：http://omicsmaps.com/   想知道你家附近有没有基因测序中心，到这个地图里查查就知道咯~~

 初代桑格法

桑格法的核心原理非常简单，由于ddNTP的3’都不含羟基（-OH），其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP, ddCTP, ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列，如图3和图4。

YL03

图3:ddNTP比正常的dNTP还要少一个氧原子，会终止DNA链的合成。

YL04

图4:桑格法原理。

由于dNTP中混入了一定比例的某一特定的ddNTP，而且有四种不同的dNTP。那么分成四组反应，如图4（c）。分别加入ddTTP、ddCTP、ddATP和ddGTP的反应会间歇性地停止，合成出不同长度的DNA单链。电泳的结果则能告诉我们生成的DNA链的长短，进而判断每个位点的碱基是什么。

以上就是测序技术的简单发展史和初代桑格法。下期文章会带来二代和三代测序技术的内容，敬请期待。欢迎小伙伴们来信讨论！

图片来自网络，文字部分由BioEngX原创。

1.23K赞
标签:



相关文章

回复 Michaelken 取消回复

您的电子邮箱地址不会被公开。 必填项已用*标注

评论列表(246)

  1. В статье представлены ключевые моменты по актуальной теме, дополненные советами экспертов и ссылками на дополнительные ресурсы. Цель материала — дать читателю инструменты для самостоятельного развития и принятия осознанных решений.
    Углубить понимание вопроса – https://f5fashion.vn/chia-se-hon-61-ve-to-mau-pony-cong-chua

    回复

  2. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Это стоит прочитать полностью – http://apskota.co.in/aps_i-annual-function6x8

    回复

  3. Эта обзорная заметка содержит ключевые моменты и факты по актуальным вопросам. Она поможет читателям быстро ориентироваться в теме и узнать о самых важных аспектах сегодня. Получите краткий курс по современной информации и оставайтесь в курсе событий!
    Нажми и узнай всё – https://f5fashion.vn/con-duong-o-dep-nhu-troi-tay-vua-xuat-hien-o-ha-noi

    回复

  4. Эта информационная статья содержит полезные факты, советы и рекомендации, которые помогут вам быть в курсе последних тенденций и изменений в выбранной области. Материал составлен так, чтобы быть полезным и понятным каждому.
    Смотрите также… – https://f5fashion.vn/chia-se-voi-hon-67-ve-background-sinh-nhat-cho-be-trai-moi-nhat

    回复

  5. Этот информативный текст отличается привлекательным содержанием и актуальными данными. Мы предлагаем читателям взглянуть на привычные вещи под новым углом, предоставляя интересный и доступный материал. Получите удовольствие от чтения и расширьте кругозор!
    Провести детальное исследование – https://www.wesend.com.ar/2023/06/22/the-power-of-effective-communication-in-business

    回复

  6. Эта информационная статья содержит полезные факты, советы и рекомендации, которые помогут вам быть в курсе последних тенденций и изменений в выбранной области. Материал составлен так, чтобы быть полезным и понятным каждому.
    Узнать из первых рук – https://tki.smk1kalianget.sch.id/enhance-customer-engagement-with-our-digital-product

    回复

  7. Предлагаем вашему вниманию интересную справочную статью, в которой собраны ключевые моменты и нюансы по актуальным вопросам. Эта информация будет полезна как для профессионалов, так и для тех, кто только начинает изучать тему. Узнайте ответы на важные вопросы и расширьте свои знания!
    Информация доступна здесь – https://salwaspherellc.com/2024/12/17/revlon-timeless-beauty-for-every-moment

    回复

  8. Эта обзорная заметка содержит ключевые моменты и факты по актуальным вопросам. Она поможет читателям быстро ориентироваться в теме и узнать о самых важных аспектах сегодня. Получите краткий курс по современной информации и оставайтесь в курсе событий!
    Следуйте по ссылке – https://exonmachinery.com/obracarka-do-palet

    回复

  9. В этом информативном тексте представлены захватывающие события и факты, которые заставят вас задуматься. Мы обращаем внимание на важные моменты, которые часто остаются незамеченными, и предлагаем новые перспективы на привычные вещи. Подготовьтесь к тому, чтобы быть поглощенным увлекательными рассказами!
    Следуйте по ссылке – https://clovisdepaula.com.br/hello-world

    回复

  10. Эта публикация завернет вас в вихрь увлекательного контента, сбрасывая стереотипы и открывая двери к новым идеям. Каждый абзац станет для вас открытием, полным ярких примеров и впечатляющих достижений. Подготовьтесь быть вовлеченными и удивленными каждый раз, когда продолжите читать.
    Детальнее – https://www.hermanosdelasaguas.org/exposicion-hermandad-de-la-paz-75-anos-2a-parte

    回复

  11. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Подробнее – https://f5fashion.vn/cap-nhat-voi-hon-83-ve-hinh-nen-may-tinh-de-nhin

    回复

  12. Предлагаем вашему вниманию интересную справочную статью, в которой собраны ключевые моменты и нюансы по актуальным вопросам. Эта информация будет полезна как для профессионалов, так и для тех, кто только начинает изучать тему. Узнайте ответы на важные вопросы и расширьте свои знания!
    Открыть полностью – https://www.icnhindi.com/2017/12/01/%E0%A4%B2%E0%A4%96%E0%A4%A8%E0%A4%8A-%E0%A4%95%E0%A5%8B-%E0%A4%AA%E0%A4%B9%E0%A4%B2%E0%A5%80-%E0%A4%AC%E0%A4%BE%E0%A4%B0-%E0%A4%AE%E0%A4%BF%E0%A4%B2%E0%A5%80-%E0%A4%AE%E0%A4%B9%E0%A4%BF%E0%A4%B2

    回复

  13. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Доступ к полной версии – https://f5fashion.vn/chi-tiet-61-ve-anh-buon-cua-con-trai

    回复

  14. В этой статье вы найдете познавательную и занимательную информацию, которая поможет вам лучше понять мир вокруг. Мы собрали интересные данные, которые вдохновляют на размышления и побуждают к действиям. Открывайте новую информацию и получайте удовольствие от чтения!
    Обратитесь за информацией – https://f5fashion.vn/top-54-ve-xe-honda-pcx-moi-hay-nhat

    回复

  15. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Секреты успеха внутри – http://zebrapen.ru

    回复

  16. Этот информационный материал собраны данные, которые помогут лучше понять текущие тенденции и процессы в различных сферах жизни. Мы предоставляем четкий анализ, графики и примеры, чтобы информация была не только понятной, но и практичной для принятия решений.
    Более того — здесь – https://f5fashion.vn/chi-tiet-52-ve-sinh-nhat-ace-hay-nhat

    回复

  17. Этот обзор медицинских исследований собрал самое важное из последних публикаций в области медицины. Мы проанализировали ключевые находки и представили их в доступной форме, чтобы читатели могли легко ориентироваться в актуальных темах. Этот материал станет отличным подспорьем для изучения медицины.
    Получить дополнительную информацию – https://detskoe-menu.ru/aktual-nost-kapel-nicy-ot-toksinov-v-sankt-peterburge-ot-kliniki-narkolog-ekspress

    回复

  18. Мы предлагаем вам подробное руководство, основанное на проверенных источниках и реальных примерах. Каждая часть публикации направлена на то, чтобы помочь вам разобраться в сложных вопросах и применить знания на практике.
    Доступ к полной версии – https://f5fashion.vn/8-cach-lam-sua-hat-dieu-tuoi-thom-ngon-don-gian-tot-cho-suc-khoe

    回复

  19. В данной статье мы акцентируем внимание на важности поддержки в процессе выздоровления. Мы обсудим, как друзья, семья и профессионалы могут помочь тем, кто сталкивается с зависимостями. Читатели получат практические советы, как поддерживать близких на пути к новой жизни.
    Ознакомиться с деталями – https://jizne.ru/novosti/kapelnitsa-ot-poxmelya-v-narkologicheskoj-klinike-narkolog-ekspress.html

    回复

  20. Эта обзорная заметка содержит ключевые моменты и факты по актуальным вопросам. Она поможет читателям быстро ориентироваться в теме и узнать о самых важных аспектах сегодня. Получите краткий курс по современной информации и оставайтесь в курсе событий!
    Ознакомиться с деталями – https://f5fashion.vn/chi-tiet-voi-hon-57-ve-hinh-nen-dien-thoai-galaxy-dep-hay-nhat

    回复

  21. Эта информационная заметка содержит увлекательные сведения, которые могут вас удивить! Мы собрали интересные факты, которые сделают вашу жизнь ярче и полнее. Узнайте нечто новое о привычных аспектах повседневности и откройте для себя удивительный мир информации.
    Не пропусти важное – https://nasdaq.youforest.net/demo5/downloads/one-up-on-wall-street

    回复

  22. В статье представлены ключевые моменты по актуальной теме, дополненные советами экспертов и ссылками на дополнительные ресурсы. Цель материала — дать читателю инструменты для самостоятельного развития и принятия осознанных решений.
    Практические советы ждут тебя – https://theaiminstitute.com/innovation/vitality-index-improvement-time-for-two-new-innovation-metrics

    回复

  23. Эта статья для ознакомления предлагает читателям общее представление об актуальной теме. Мы стремимся представить ключевые факты и идеи, которые помогут читателям получить представление о предмете и решить, стоит ли углубляться в изучение.
    Изучить аспект более тщательно – https://www.wakeup-radio.com/qtvideo/pon-pon-girl

    回复

  24. В этой статье вы найдете познавательную и занимательную информацию, которая поможет вам лучше понять мир вокруг. Мы собрали интересные данные, которые вдохновляют на размышления и побуждают к действиям. Открывайте новую информацию и получайте удовольствие от чтения!
    Ознакомиться с полной информацией – https://www.kayrana.com/designers-shaking-up-modern-furniture

    回复

  25. Мы предлагаем вам подробное руководство, основанное на проверенных источниках и реальных примерах. Каждая часть публикации направлена на то, чтобы помочь вам разобраться в сложных вопросах и применить знания на практике.
    Ознакомьтесь с аналитикой – https://www.hamedanhaji.ir/%D8%B3%DB%8C%D9%84%DB%8C%D8%B3%DB%8C%D9%85-%D8%AF%DB%8C%E2%80%8C%D8%A7%DA%A9%D8%B3%DB%8C%D8%AF

    回复

  26. Этот информационный материал собраны данные, которые помогут лучше понять текущие тенденции и процессы в различных сферах жизни. Мы предоставляем четкий анализ, графики и примеры, чтобы информация была не только понятной, но и практичной для принятия решений.
    Осуществить глубокий анализ – http://www.mitsubishi-spb.ru

    回复

  27. Эта публикация завернет вас в вихрь увлекательного контента, сбрасывая стереотипы и открывая двери к новым идеям. Каждый абзац станет для вас открытием, полным ярких примеров и впечатляющих достижений. Подготовьтесь быть вовлеченными и удивленными каждый раз, когда продолжите читать.
    Смотрите также… – http://alinkinblog.ru

    回复

  28. В этой статье представлен занимательный и актуальный контент, который заставит вас задуматься. Мы обсуждаем насущные вопросы и проблемы, а также освещаем истории, которые вдохновляют на действия и изменения. Узнайте, что стоит за событиями нашего времени!
    Только для своих – https://saga-trans.com/portfolio/organization-design-2

    回复

  29. В этой статье представлен занимательный и актуальный контент, который заставит вас задуматься. Мы обсуждаем насущные вопросы и проблемы, а также освещаем истории, которые вдохновляют на действия и изменения. Узнайте, что стоит за событиями нашего времени!
    Что ещё? Расскажи всё! – https://www.volleymsk.ru/forum/viewtopic.php?t=5176&start=15

    回复

  30. Эта публикация завернет вас в вихрь увлекательного контента, сбрасывая стереотипы и открывая двери к новым идеям. Каждый абзац станет для вас открытием, полным ярких примеров и впечатляющих достижений. Подготовьтесь быть вовлеченными и удивленными каждый раз, когда продолжите читать.
    Расширить кругозор по теме – https://newssamiksha.com/index.php/2023/06/20/bri-teresi-biography

    回复

  31. Этот информативный текст выделяется своими захватывающими аспектами, которые делают сложные темы доступными и понятными. Мы стремимся предложить читателям глубину знаний вместе с разнообразием интересных фактов. Откройте новые горизонты и развивайте свои способности познавать мир!
    Читать дальше – https://www.cchppb.fr/dechetterie-de-pitaugier-a-mane

    回复

  32. Эта публикация завернет вас в вихрь увлекательного контента, сбрасывая стереотипы и открывая двери к новым идеям. Каждый абзац станет для вас открытием, полным ярких примеров и впечатляющих достижений. Подготовьтесь быть вовлеченными и удивленными каждый раз, когда продолжите читать.
    Углубить понимание вопроса – https://alyadgroup.com/inicio/sales-management2

    回复

  33. Эта информационная заметка содержит увлекательные сведения, которые могут вас удивить! Мы собрали интересные факты, которые сделают вашу жизнь ярче и полнее. Узнайте нечто новое о привычных аспектах повседневности и откройте для себя удивительный мир информации.
    Смотри, что ещё есть – http://jandconcierge.com/author/xikykjjw

    回复

  34. В этой информационной статье вы найдете интересное содержание, которое поможет вам расширить свои знания. Мы предлагаем увлекательный подход и уникальные взгляды на обсуждаемые темы, побуждая пользователей к активному мышлению и критическому анализу.
    Заходи — там интересно – https://talleresmelli.com/%D0%BE%D0%BC%D0%B3-%D1%81%D1%81%D1%8B%D0%BB%D0%BA%D0%B0-%D1%81%D0%B0%D0%B9%D1%82-omg-%D0%B2-tor

    回复

  35. Этот интересный отчет представляет собой сборник полезных фактов, касающихся актуальных тем. Мы проанализируем данные, чтобы вы могли сделать обоснованные выводы. Читайте, чтобы узнать больше о последних трендах и значимых событиях!
    Погрузиться в детали – https://crossriver.ca/service/guided-rafting-trip-2

    回复

  36. В этой статье вы найдете познавательную и занимательную информацию, которая поможет вам лучше понять мир вокруг. Мы собрали интересные данные, которые вдохновляют на размышления и побуждают к действиям. Открывайте новую информацию и получайте удовольствие от чтения!
    Изучить вопрос глубже – https://www.fritsfrietman.nl/2015-galerie-artibrak-bij-museum-swaensteijn-in-voorburg/tentoonstellingen-exhibitions

    回复

  37. Мы собрали для вас самые захватывающие факты из мира науки и истории. От малознакомых деталей до грандиозных событий — эта статья расширит ваш кругозор и подарит новое понимание того, как устроен наш мир.
    Это стоит прочитать полностью – https://awanderingsteeper.com/shelf-life-tea-leaves

    回复

  38. Эта обзорная заметка содержит ключевые моменты и факты по актуальным вопросам. Она поможет читателям быстро ориентироваться в теме и узнать о самых важных аспектах сегодня. Получите краткий курс по современной информации и оставайтесь в курсе событий!
    Секреты успеха внутри – https://yesblog.ru

    回复

  39. Эта информационная заметка содержит увлекательные сведения, которые могут вас удивить! Мы собрали интересные факты, которые сделают вашу жизнь ярче и полнее. Узнайте нечто новое о привычных аспектах повседневности и откройте для себя удивительный мир информации.
    Ознакомьтесь с аналитикой – https://www.ateliersfrancochinois.com/2020/11/11/confinement-10-sur-le-cours-de-chinois-a-distance

    回复

  40. Мы предлагаем вам подробное руководство, основанное на проверенных источниках и реальных примерах. Каждая часть публикации направлена на то, чтобы помочь вам разобраться в сложных вопросах и применить знания на практике.
    Лучшее решение — прямо здесь – https://topic.lk/3725

    回复

  41. Эта публикация дает возможность задействовать различные источники информации и представить их в удобной форме. Читатели смогут быстро найти нужные данные и получить ответы на интересующие их вопросы. Мы стремимся к четкости и доступности материала для всех!
    Обратиться к источнику – https://neuarto.com/produto/exclusive-collection-t-shirt

    回复

  42. В этой статье вы найдете познавательную и занимательную информацию, которая поможет вам лучше понять мир вокруг. Мы собрали интересные данные, которые вдохновляют на размышления и побуждают к действиям. Открывайте новую информацию и получайте удовольствие от чтения!
    Ознакомиться с полной информацией – https://sunrize-web.com/info/%E6%96%B0%E5%B9%B4%E3%81%AE%E3%81%94%E6%8C%A8%E6%8B%B6

    回复

  43. Этот информативный текст отличается привлекательным содержанием и актуальными данными. Мы предлагаем читателям взглянуть на привычные вещи под новым углом, предоставляя интересный и доступный материал. Получите удовольствие от чтения и расширьте кругозор!
    Обратитесь за информацией – https://mhipcor.com/new-site

    回复

  44. Эта информационная заметка содержит увлекательные сведения, которые могут вас удивить! Мы собрали интересные факты, которые сделают вашу жизнь ярче и полнее. Узнайте нечто новое о привычных аспектах повседневности и откройте для себя удивительный мир информации.
    Ознакомьтесь с аналитикой – https://www.roek.org/jelly-jelly-jelly

    回复

  45. Мы предлагаем вам подробное руководство, основанное на проверенных источниках и реальных примерах. Каждая часть публикации направлена на то, чтобы помочь вам разобраться в сложных вопросах и применить знания на практике.
    Узнать напрямую – https://tkdworldclass.com/magna-fringilla-quis-condimentum

    回复

  46. В этой публикации мы предлагаем подробные объяснения по актуальным вопросам, чтобы помочь читателям глубже понять их. Четкость и структурированность материала сделают его удобным для усвоения и применения в повседневной жизни.
    Практические советы ждут тебя – https://artyaska.pro/an-endless-search-for-a-perfect-music-symphony

    回复

  47. Этот увлекательный информационный материал подарит вам массу новых знаний и ярких эмоций. Мы собрали для вас интересные факты и сведения, которые обогатят ваш опыт. Откройте для себя увлекательный мир информации и насладитесь процессом изучения!
    Почему это важно? – https://bullrushacademy.com/forex-blog/forex-price-action-basics-candlestick-analysis

    回复

  48. Этот информационный обзор станет отличным путеводителем по актуальным темам, объединяющим важные факты и мнения экспертов. Мы исследуем ключевые идеи и представляем их в доступной форме для более глубокого понимания. Читайте, чтобы оставаться в курсе событий!
    Как достичь результата? – https://ceritakepuasan.online/cerita-kepuasan-nikmatnya-di-dunia-perkemahan

    回复

  49. Публикация приглашает вас исследовать неизведанное — от древних тайн до современных достижений науки. Вы узнаете, как случайные находки превращались в революции, а смелые мысли — в новые эры человеческого прогресса.
    Подробная информация доступна по запросу – https://przejdznaswoje.pl/wypozyczalnia-koz-pomyslem-na-biznes

    回复

  50. Этот увлекательный информационный материал подарит вам массу новых знаний и ярких эмоций. Мы собрали для вас интересные факты и сведения, которые обогатят ваш опыт. Откройте для себя увлекательный мир информации и насладитесь процессом изучения!
    Обратитесь за информацией – https://kunst-plus-kultur.de/summer-is-the-best-time-for-home-painting

    回复

  51. Публикация приглашает вас исследовать неизведанное — от древних тайн до современных достижений науки. Вы узнаете, как случайные находки превращались в революции, а смелые мысли — в новые эры человеческого прогресса.
    Уточнить детали – https://f5fashion.vn/top-voi-hon-53-ve-to-mau-lau-dai-hay-nhat

    回复

  52. Эта публикация дает возможность задействовать различные источники информации и представить их в удобной форме. Читатели смогут быстро найти нужные данные и получить ответы на интересующие их вопросы. Мы стремимся к четкости и доступности материала для всех!
    Лучшее решение — прямо здесь – http://www.indetac.com/speed-dating-bergen-speed-dating-oslo-suomi-escort-tantra-massage-goteborg

    回复

  53. Эта публикация завернет вас в вихрь увлекательного контента, сбрасывая стереотипы и открывая двери к новым идеям. Каждый абзац станет для вас открытием, полным ярких примеров и впечатляющих достижений. Подготовьтесь быть вовлеченными и удивленными каждый раз, когда продолжите читать.
    Осуществить глубокий анализ – https://artparcos.com/producto/el-david

    回复

  54. Этот интересный отчет представляет собой сборник полезных фактов, касающихся актуальных тем. Мы проанализируем данные, чтобы вы могли сделать обоснованные выводы. Читайте, чтобы узнать больше о последних трендах и значимых событиях!
    Все материалы собраны здесь – https://guayabo.co/hola-mundo

    回复

  55. Предлагаем вашему вниманию интересную справочную статью, в которой собраны ключевые моменты и нюансы по актуальным вопросам. Эта информация будет полезна как для профессионалов, так и для тех, кто только начинает изучать тему. Узнайте ответы на важные вопросы и расширьте свои знания!
    Подробная информация доступна по запросу – http://sakurakoumuten.net/wp/2018/09/27/%E5%8F%B0%E9%A2%A824%E5%8F%B7%E3%81%AE%E6%8E%A5%E8%BF%91%E3%81%AB%E3%81%A4%E3%81%84%E3%81%A6%EF%BC%889-30%E3%81%AF%E6%97%A5%E6%9B%9C%E6%97%A5%E3%81%AE%E3%81%9F%E3%82%81%E9%9B%BB%E8%A9%B1%E5%AF%BE

    回复

  56. Этот увлекательный информационный материал подарит вам массу новых знаний и ярких эмоций. Мы собрали для вас интересные факты и сведения, которые обогатят ваш опыт. Откройте для себя увлекательный мир информации и насладитесь процессом изучения!
    Подробнее можно узнать тут – https://vyvod-iz-zapoya-1.ru/

    回复

  58. I like what you guys are up too. Such clever work and reporting! Carry on the excellent works guys I’ve incorporated you guys to my blogroll. I think it’ll improve the value of my site :).

    回复

  59. constantly i used to read smaller articles or reviews that. also clear their motive, and that is also happening…with this post which I am reading here.

    isilparkhotel.com.tr

    回复

  60. I could not resist commenting. Very well written!

    [url=https://nic.icu/marketing/download-rajbet-on-ios-for-a-bonus-easy-registration/]nic.icu[/url]

    回复
  62. 🖋 Email- You got a transfer NoYB92. Go to withdrawal >> https://telegra.ph/Go-to-your-personal-cabinet-08-25?hs=917b77d887b3f22116a3867032d1032f& 🖋说道：

    39b16l

    回复

  84. “Nope.” He says. Flatly. As he runs his hand over his still steely-hard length of his curved cock. “What?’ He balks at the suggestion from his dad.

    回复

  85. Thanks a lot, A lot of tips!
    online casino sign up bonuses [url=https://usagamblinghub.com/#]casino live online[/url] coin pusher casino online

    回复

  86. You have made your point extremely well.!
    do any online casinos accept american express [url=https://usacasinomaster.com/#]new online casino no deposit bonus usa[/url] betamerica pa online casino

    回复

  87. You actually reported this adequately.
    how to own an online casino [url=https://luckyusaplay.com/#]best online casinos for usa[/url] casino igre online

    回复

  88. “Yeah.” He answers his dad. “…and I was ‘going commando’ too.” [url=https://arturzasada.pl/]polskie porno[/url] “Was it because of that?” His dad asks as he points a finger towards him. And his midsection.

    回复

  89. Seriously loads of superb material.
    888 us online casino [url=https://luckyusaplay.com/#]online casino sites[/url] 11clubs casino online malaysia

    回复

  94. You made your position extremely effectively!.
    online casino offering cashback on losses [url=https://luckyusaplay.com/#]play casino online free[/url] free online casino games no registration

    回复

  98. Nicely put, Thanks.
    platinum reels online casino [url=https://usaplayerscasino.com/#]online casino no deposit bonus codes[/url] kostenlos online casino

    回复

  100. With thanks. Valuable information!
    live casino online philippines [url=https://usacasinomaster.com/#]free casino online games[/url] app da casino online

    回复

  107. Incredible all kinds of helpful knowledge!
    melhor casino online portugues [url=https://luckyusaplay.com/#]best casino online[/url] best online casino payout percentages

    回复

  115. This is nicely expressed. .
    online casinos that payout instantly [url=https://usaplayerscasino.com/#]online casino welcome bonus[/url] casinos online em portugues

    回复

  118. Fine tips. Many thanks.
    wynnbet online casino pa no deposit bonus codes [url=https://luckyusaplay.com/#]no deposit online casinos[/url] online casinos nevada

    回复

  122. Kudos! Quite a lot of stuff.
    666 casino online review [url=https://usacasinomaster.com/#]new online casino usa[/url] 007 casino royale 1080p online

    回复

  125. Good postings. Many thanks.
    royal vegas online casino free slots [url=https://uscasinoguides.com/#]casinos gambling online[/url] slots era best online casino slots machines

    回复

  126. You explained that perfectly!
    online casino dc [url=https://usaplayerscasino.com/#]top online casino[/url] vegas casino online no deposit bonus code

    回复

  128. Seriously tons of excellent material!
    casino online seriös [url=https://usagamblinghub.com/#]online casino gambling[/url] america online real money casino

    回复

  130. Point clearly regarded!!
    online casino flexepin [url=https://usacasinomaster.com/#]best online casino bonus[/url] mejores casinos online en colombia

    回复

  132. Lovely posts, With thanks!
    most played online casinos [url=https://luckyusaplay.com/#]casino online games free[/url] casino online malaysia download

    回复

  134. Wow loads of very good knowledge.
    do online casinos really pay out [url=https://usaplayerscasino.com/#]play casino online[/url] 888 online casino ontario

    回复

  136. Useful advice. Many thanks!
    casino gta v online [url=https://usagamblinghub.com/#]top 10 online casinos[/url] mgm online casino real money

    回复
联系我们

联系我们

(44)07934433023

在线咨询: QQ交谈

邮箱: info@bioengx.org

关注微信
微信扫一扫关注我们

微信扫一扫关注我们

关注微博
返回顶部