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表达蛋白,你用什么系统?

当你决定克隆或者表达某个蛋白质时,你需要考虑使用哪些表达系统。

目前有以下一些可以适用于大规模生产蛋白的表达系统:

大肠杆菌表达系统

用大肠杆菌进行蛋白表达是最简单、最快、最便宜的方法。现在有很多商业和非商业的表达载体可以应用,这些载体通常包含有N-和C-末端的纯化标签。另外,很多菌种已经被优化可用于特定蛋白的表达。

酵母表达系统

酵母菌是一类真核微生物, 相比于大肠杆菌,酵母菌有一些较为突出优点。其优点之一就是,酵母菌培养能够达到一个很高的浓度,这使得酵母菌更适用于同位素标记蛋白的表达生产。最常用的两种酵母菌株是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母( Pichia pastoris)。

昆虫细胞表达系统

昆虫细胞是比酵母更高级的真核生命表达系统,能够更好地进行蛋白翻译后的加工修饰。因此,当你想要表达某种哺乳动物的蛋白时,使用昆虫细胞作为表达系统,能够使你有更大的机会去获得可溶性蛋白。使用昆虫细胞表达蛋白的不足之处在于成本较高,而且还需要很长的时间才能得到你的蛋白(通常两周)。

哺乳动物表达系统

很多实验室将HEK(人胚肾)细胞系和CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系,用于表达制备更加复杂的、需要适当翻译后修饰的蛋白。这两个细胞系既可以用于瞬时表达也可以用于稳定系表达。稳定的细胞系表达需要消耗一定的时间,但也具有更高的生产率以及更少的变异。另外,这些细胞对分泌蛋白具有高表达能力(商业蛋白高达10或100毫克每升,甚至往往几克每升),但胞内蛋白的表达水平通常都比较低。

如何判断哪种表达系统更利于自己的研究呢?你需要问自己这几个问题:

1. 想要表达什么类型的蛋白?

当你想要表达的是一个原核蛋白时,很明显应该选择大肠杆菌。这个方法迅速价廉,同时大肠杆菌具有针对原核蛋白的所有折叠和翻译后修饰功能。如果是真核蛋白的话,表达方法的选择就取决于更多的因素了(见下文)。

2. 用大肠杆菌表达时能得到可溶性蛋白吗?

鉴于前面提到的种种原因,真核蛋白的表达通常也将大肠杆菌作为首选表达方法。然而,许多真核蛋白在大肠杆菌内表达时不能进行适当的折叠,从而会形成不可溶的聚集体(也称包涵体)。当然有时候,将包涵体溶解,或是通过低温表达蛋白来提高溶解度是有可能实现的。另外,恰当的使用分子伴侣如谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-S-transferase ,GST),麦芽糖结合蛋白(MBP)等也可以提高目的蛋白的溶解性。然而与其尝试10种不同的大肠杆菌,不如换用真核表达系统。

3. 表达的蛋白需要翻译后修饰吗?

许多蛋白为了获得相应的活性或是正确的结构,需要在翻译后进行修饰。最简单的一种修饰是发生在所有的生物体中的去除N-末端的蛋氨酸残基。更复杂的修饰,如N/O–糖基化,N/O–磷酸化则只发生在部分真核细胞中。

4. 表达的蛋白用到哪些密码子?

我们知道,在生命体中61个密码子的使用频率是不一样的。有些密码子非常重要,是由于它们出现在高水平表达基因中,而一些低频密码子则出现在低表达水平的基因中。对于不同的生命体,低频密码子也不尽相同,这取决于生命体本身。不同系统使用密码子情况可以在condon usage database中获知(http://www.kazusa.or.jp/codon/)。往往,密码子的使用频率反应了同源tRNA的数量水平。因此,当你的目的蛋白的密码子用法与宿主的密码子用法不同时,有可能在表达蛋白时会出现问题。下面这些问题经常发生:

  • 翻译中止。这会导致一系列片段蛋白的产生。
  • 开放阅读框错位(Frame shifting)。
  • 氨基酸的错配。例如,使用AGA密码子编码精氨酸时,可能会导致赖氨酸与精氨酸之间的替换。AGA密码子在真核生物中非常常见,但在大肠杆菌中却很少见。赖氨酸替换精氨酸后,会导致蛋白质相对分子量降低28Da,这是因为赖氨酸的侧链比精氨酸的侧链少了两个N原子,相对分子量的差别可以通过质谱检测到。
  • 抑制蛋白合成或细胞生长。这导致的结果是,观察到的蛋白质表达水平很低甚至根本没有表达。特别是低频密码子出现在mRNA的5’端或连续出现的情况下(mRNA5’端是翻译开始的位置,这里出现稀有密码子,翻译无法开始),可以观察到蛋白质表达表达水平是非常低的,同时也会观察到片段化的蛋白产物。

要想提高大肠杆菌中含有低频密码子蛋白的表达水平,有以下两个方法:

          定点突变。在具有相同的残基情况下,用高频密码子去替换低频密码子。如,大肠杆菌中的精氨酸低频密码子AGA, AGG可以用高频密码子CGC替换。
• 
与编码稀有tRNA的基因共表达。下面的表格提供了几个可以用于编码多个稀有tRNA的大肠杆菌菌株

菌株 可提供的稀有tRNA 供应商
BL21 (DE3) CodonPlus-RIL AGG/AGA (精氨酸), AUA(异亮氨酸) and CUA (亮氨酸) Stratagene
BL21 (DE3) CodonPlus-RP AGG/AGA (精氨酸) and CCC(脯氨酸) Stratagene
Rosetta or Rosetta (DE3) AGG/AGA (精氨酸), CGG(精氨酸), AUA (异亮氨酸)
CUA (亮氨酸), CCC (脯氨酸), andGGA (甘氨酸)
Novagen

利用这些菌株进行基因表达时,你经常会得到完整蛋白和被截断的片段蛋白的混合物。利用C-末端纯化标记(比如His tag),可以采用亲和层析的方法纯化到完整蛋白。当用上面两种方法来提高蛋白质的表达水平都失败的情况下,就需要考虑改用其他表达系统如酵母菌和昆虫细胞等。如果目的蛋白包含了很多大肠杆菌的低频密码子,最好直接采用真核表达系统。最后我们通过一张表系统的了解不同表达系统的特点。

特点 大肠杆菌 酵母菌 昆虫细胞 哺乳动物细胞
细胞生长速率 快 (30 min) 快 (90 min) 慢(18-24 h) 慢 (24 h)
生长培养基的复杂程度 简单 简单 复杂 复杂
生长培养基的成本
表达水平 低 – 高 低 – 高 低 – 中等
胞外表达情况 分泌至周质 分泌至培养基 分泌至培养基 分泌至培养基
蛋白折叠 通常需要复性 可能需要复性 正确折叠 正确折叠
N-联 糖基化 高甘露糖 简单,无唾液酸 复杂
O-联 糖基化
磷酸化
乙酰化
酰化
羰基化

References

Protein Expression. A practical approach (Higgins. S.J. & Hames, B.D., eds), Oxford University Press, 1999.
Kane, J.F. (1995) Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins inEscherichia coli. Current Opinions Biotechnol. 6, 494-500.

Zhang, S., Zubay, G. & Goldman, E. (1991) Low-usage codons in Escherichia coli, yeast, fruit fly and primates. Gene 105 , 61-72.
Calderone T L, Stevens R D, Oas T G. High-level Misincorporation of Lysine for Arginine at AGA Codons in a Fusion Protein Expressed inEscherichia coli[J]. Journal of molecular biology, 1996, 262(4): 407-412.

Novy, R., Drott, D., Yaeger, K. & Mierenhof, R. (2001) Overcoming the codon bias of E. coli for enhanced protein expression. inNovations 12 , 1-3.


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作者: 陈玫君

现任广州再生医学实验室研究实习员,苏州大学生物科学专业本科毕业,研究内容主要涉及分子生物学以及单细胞测序相关分析,曾实习于中科院上海植生所。



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